iRNA抗肺癌.docVIP

利用RNA干扰（iRNA）技术治疗肺癌 唐翔宇 王锦峰 王皓 孔一凡 周骏 摘要：治愈肿瘤一直是一个难题， iRNA干扰技术的成熟和基于纳米技术的药物输送系统为药物向肿瘤组织、肿瘤细胞的有效输送提供了条件。纳米载体可通过被动靶向、主动靶向和刺激响应性靶向等方式增加药物在肿瘤部位的蓄积, 克服外排蛋白作用, 提高药物在肿瘤细胞内的浓度, 控制药物在特定细胞器释放和释放时间以及修复被阻断的细胞凋亡通路, 增强细胞对化疗药物的敏感性。通过iRNA干扰技术将有丝分裂激酶送入病灶，从而干扰癌细胞的分裂过程，达到治疗癌症的目的。 关键字： 肺癌； 有丝分裂激酶； iRNA；纳米载体 总流程（分工） Part1 选择，提取，筛选，扩增目标基因（唐翔宇 周骏） Part2 选择载体（孔一凡）载体-目标基因结合（王锦峰） 药物的靶向传输和释放（王皓） Part3 观测实验效果，评价修改药品（唐翔宇 王皓） Part1：选择，提取，筛选，扩增目标基因 思路：利用该蛋白质抗体分离对应的mRNA多聚核糖体，然后分离mRNA，再反转录获得cDNA。 流程图： 从癌症患者处获得肺癌细胞，提取该种细胞分裂所必须的蛋白质有丝分裂激酶 制取该蛋白质的抗体：有丝分裂激酶C抗体 利用所得抗体获得该蛋白质所对应的mRNA 利用PCR扩增技术获得大量的小分子双链RNA 蛋白质抗体的选择： 选择肺癌细胞分裂阶段的有丝分裂激酶作目标蛋白。 （有丝分裂激酶是激酶中的一种，这种酶利用磷酸盐催化反应促进细胞分裂[1]）。 获取方法：将有丝分裂激酶C抗体注入癌细胞内。培养段时间后，破碎癌细胞。分离出带有mRNA核糖体的有丝分裂激酶。此时，正处于翻译阶段的蛋白酶1，可带出对应的mRNA片段。分离后获得mRNA[2]。 有丝分裂激酶的提取： 从癌症患者血液中提取少量的癌细胞放入培养皿培养 取培养所得癌细胞碾碎放入离心管离心 取上清液，加入酸或碱，将PH值调至该癌细胞生命活动所必需的蛋白质的等电点 将调好PH的溶液再次离心，弃上清夜，取所得沉淀即为所要提取的蛋白质 有丝分裂激酶C抗体的制备： 首次免疫：取上述取得的蛋白质作为抗原，与弗氏完全佐试剂乳化，注射到小鼠体内 第一次加强免疫：蛋白质抗原与弗氏不完全佐试剂乳化，注射到小鼠体内 第二次加强免疫：蛋白质抗原与弗氏不完全佐试剂乳化免疫一周后，取小鼠血样+ELISA检测效价，直到效价合格为止 第三次加强免疫：重复第二次加强免疫操作直到效价合格为止 纯蛋白抗原免疫：单独抗原直接免疫三天后采血（血清做阳性对照）。 取脾细胞融合：sp2/0骨髓癌细胞与一只小鼠（ELISA效价较高的）的脾细胞融合HAT选择交瘤细胞及杂交瘤细胞的筛选亚克隆：ELISA检测筛选阳性细胞克隆，至少进行两次杂交瘤细胞的亚克隆，直至细胞上清液的ELISA结果阳性率达100%。 完成细胞建株亚类鉴定：对杂交瘤细胞株进行亚类鉴定 冷存细胞株：每种抗原提供三株杂交瘤细胞 制备腹水并纯化：接种细胞制备腹水，ProteinA/G纯化 提取抗体：从腹水中提取抗体 Part2：药用纳米粒的制备 载体-目标基因结合 目标基因的释放 流程图 由part1制得的药物（小分子双链RNA）制备药用纳米粒 对制备出来的纳米粒进行表面修饰 磁性物质的制备及其用偶联剂与药用纳米粒的连接 对具有磁性的纳米粒药物靶向传输和生物降解释放 纳米粒的制备 常用的聚合物 聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸共聚乙醇酸（PLGA）、聚己内酯（PCL）、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐。 常用的方法 溶剂蒸发法、自发乳化溶剂扩散法、盐析乳化-扩散法、纳米沉积法、超临界流体技术、亲水性聚合物凝聚法、乳液聚合、界面凝合法等等。 我组采用的是溶剂蒸发法 我组采用聚乳酸作为纳米药物载体。但是因为单一聚合物的性质在应用上有一定局限性。所以采用聚乳酸和羟基乙酸共聚物（PLGA）构成纳米粒的内核更为有效。 因为PLGA可以通过水解作用降解，体内降解速度可以通过体外降解的数据进行预测。另外其降解产物为乳酸和羟基乙酸，这些产物在体内自然存在。 纳米粒与药物的整合 溶剂蒸发法包装药物RNA 将聚合物PLGA溶解在有机溶剂二氯甲烷中，再将所制备的小分子双链RNA溶解或分散到含有PLGA的溶液里。在水和乳化剂的存在下，经高压乳匀或超声后，经连续搅拌及一定温度和压力条件下蒸去溶剂即得水包油（OPW）纳米混悬液。 纳米粒的表面改性 作用 表面改性赋予纳米粒表面以亲水性，以减少巨噬细胞吞噬，延长体循环的时间，增加对细胞膜的粘附能力等。 表面活性剂处理 是在静电相互作用下，通过纳米粒子的高能表面吸附表面活性剂的极性基团而达到目的。在一定条件下