DNA,RNA提取原理方法和琼脂糖凝胶电泳,PCR技术,限制性内切酶简介要点.ppt

RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径 1)，提取总核酸，然后直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相。 2)，提取总核酸，再用氯化锂将RNA 沉淀出来； 第二种提取方法将导致小分子量RNA 的丢失，目前该方法的使用频率已很低。 方法一:总RNA 的试剂盒快速提取 ——TRIzol法 TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍(常用的RNA酶抑制剂）等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。 且是一种简便、经济、适合大量样本的RNA提取方法 1.TRIzol法 1）细胞裂解：用TRIZOL试剂直接从细胞或组织中提取总RNA 2）流程简述：提取液 加酚氯仿 水样层 （含RNA）和有机层（含蛋白和DNA ） 收集水样层 RNA 沉淀 纯化的RNA RNA 离心 异丙醇 ②乙醇、离心、去上清 基因组DNA 水相 有机相 RNA 氯仿 纯化 pH5.7 离心 加入裂解液 (TRNzol-A+) 离心、弃上清 ①离心、弃上清 晾干（不完全） 适量DEPC水溶解 TRIzol法提取流程 操作步骤 1.样品处理 组织：50-100mg组织中加入1ml TROzlo试剂。 单层细胞：加入TROzlo试剂1ml/cm2平板。 悬浮细胞：处理前洗涤细胞，以防止RNA降解。每5-10×105动物、植物或酵母细胞，或1×107细菌加入1 ml TROzlo试剂。 2.将上述样品于15-30℃静置5min，使核蛋白充分解离。 3.加入0.2ml（1 ml TROzlo试剂）氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min。 4.于2-8℃ 12000g离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。 5.取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。 6.于2-8℃ 12000g离心10min后弃去上清。 7.向沉淀中加入1ml 75%乙醇，轻轻混匀。 8.于2-8℃ 7500g离心5min后弃上清 9.将RNA样品凉干（不要彻底干燥），加入适量DEPC水溶解（可于55-60℃促溶10min）。 方法二: 氯化锂法提取总RNA 本方法用高浓度尿素来使蛋白变性和抑制RNA 酶，用氯化锂选择沉淀RNA ，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA ，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高，小RNA 片断丢失的缺陷。 1：对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中 2：匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟 3：取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2 4：沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟 5：取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。 6：70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 7：RNA 溶解液溶解沉淀，得RNA ，分装，于－70℃保存。  扩展： RT-PCR * RT-PCR原理 原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。 逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。 总RNA的提取 cDNA第一链