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切割DNA分子时产生的两种不同末端 BACK EcoRI限制酶的切割： 中轴线 黏性末端 黏性末端 在G与A之间切割 大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 BACK C C C G G G G G G C C C 中轴线 SmaI限制酶的切割： C C C G G G G G G C C C 平末端 平末端 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 Sma Ⅰ 平末端　　　平末端 SmaI限制酶的切割： 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 什么叫平末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 BACK 三 模拟操作：重组DNA分子的模拟操作 注意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。 首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对； 第二，每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识别序列，并存在G-A的切割位点。 标记基因 抗四环素的基因 抗氨苄青霉素的基因 特定颜色的基因 四环素 氨苄青霉素 4.标记基因的作用及其应用 习题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么?请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论 对照组：不添加抗生素 实验组1：添加一定浓度的四环素 实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素 实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素 对照组 实验组1 实验组2 实验组3 结 论 预期一 + + + + 既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因 预期二 + + — — 只含有抗四环素基因 预期三 + — + — 只含有抗氨苄青霉素基因 预期四 + — — — 既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因 问题探讨： 　　　苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 　　　让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 苏云金芽孢杆菌 毒蛋白 普通棉花　　抗虫棉 1.1 DNA重组技术的基本工具 想一想：需要做哪些关键工作？ 基因工程培育抗虫棉的简要过程： 普通棉花(无抗虫特性) 苏云金杆菌 提取 抗虫基因 与运载体DNA拼接 导入 棉花细胞(含抗虫基因) 棉花植株(有抗虫特性) 上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？ 1.1 DNA重组技术的基本工具 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一： 从苏云金杆菌细胞内提取出抗虫基因 关键步骤二： 抗虫基因与运载体DNA拼接 关键步骤三： 抗虫基因导入受体(棉花)细胞 1.1 DNA重组技术的基本工具 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ “分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶 关键步骤一： 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 关键步骤二： 抗虫基因与载体DNA“缝合” 关键步骤三： 抗虫基因进入棉花细胞 “分子缝合针”—— DNA连接酶 “分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体 1.1 DNA重组技术的基本工具 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” ①来源： 主要从原核生物中分离纯化出来。 ②种类： 已从近300种微生物中分离出约4000种限制酶。 ③作用： 1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列 2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 具有特异性。 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子， ④作用特点： 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成 ⑤限制酶的识别序列： 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” ⑥形成两种末端 粘性末端 平末端 EcoRI限制酶的切割： SmaI限制酶的切割 回文序列 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。 思考? DNA聚合酶 DNA连接酶 区别1 区别2 相同点 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? 1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键 1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互