高效液相色谱仪使用与维护要点.pptVIP

高效液相色谱仪使用与维护 驻马店市食品药品检验所 付清华 2011-03 液相色谱理论发展简况 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究植物叶子的组成时所用的一种方法。他用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物。 他把干燥的碳酸钙粉末装到一根长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上就形成了三种颜色的6个色带。 液相色谱理论发展简况 当时，茨维特把这种色带叫做色谱(Chromatography)，色谱法因之得名。 在这一方法中，把玻璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”，纯净的石油醚叫做“流动相”。这就是最早的液固色谱法。 后来在此基础上又发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 色谱法的分离原理是： 溶于流动相(mobile phase)中的各组分，经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，那么在固定相中滞留的时间就不同，故从固定相中流出的先后也就不同。 这种方法被称为色层法、层析法。 液相色谱理论发展简况 它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 HPLC系统 一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。 高效液相色谱仪( HPLC) 目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等， 国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。 开机前的准备工作 1、将试验要求的流动相配制好。 2、流动相要过滤脱气。 3、装好试验要求的色谱柱。 开机前的准备工作 流动相要过滤:以除去其中的微粒物质。 滤 膜：(0.45μm) ①脂溶性滤膜（有机滤膜）， ②水溶性滤膜， ③通用型滤膜(聚四氟乙烯能适用于所有溶剂)。 HPLC级溶剂（色谱纯）使用时不必再过滤了，因生产工艺中已用0.2μm的过滤装置过滤过了。 开机前的准备工作 脱 气：为了防止在泵中、流路中、及检测器中产生气泡，而影响泵不稳定性（使流速不稳）和增加检测器的噪声，流动相必须脱气。 混合流动相比纯溶剂更能溶解空气，极易饱和形成气泡，有水的流动相特别明显。 脱气方法：①氦气脱气，②真空脱气（用真空过滤流动相脱气，在线脱气机脱气）， ③ 超声脱气， ④加热脱气。 以不使流动相中混合物浓度发生变化为原则。 贮液瓶 贮液瓶是用来装流动相的容器，里面还含有一个不锈钢烧结过滤器。 泵进液管路一般用聚四氟乙烯管。不锈钢烧结过滤器套在进液管路上，有两个功能：一是防止微粒物质进入泵，二是作为进液管路的重物，所以常被称为“沉子”。 贮液瓶如被污染了可能会阻塞过滤片，影响泵的性能(使流速不稳)，出杂峰或产生噪声。 反相色谱法　 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为极性强的水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。 适用于分离非极性和极性较弱的化合物。 RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 反相色谱柱 以硅胶为基质的液相色谱填料多为反相柱，正相柱不太多。 ①常用硅胶健合C18、C8等填料柱。 ②对硅胶做碱性脱活的反相柱（在高温下硅烷化封闭硅羟基），（这类填料对碱性物质如对胺有很小的吸附性）。 ③高稳定性反相柱（这种柱可以经过酸和碱的作用）。 反相色谱法中应注意： 尽量不使用乙酸盐缓冲溶液，因为它和带阳离子的溶质会形成非极性络合物。 不使用卤化物，以免腐蚀液相色谱仪。 对水的质量要求很高。一般应用新鲜的高纯水。乐百氏也可以用。 每次试验用水都应更换新鲜的水，因水易变质，不能长时间不更换。 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。 常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 常用