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华南农业大学　食品学院　王丽 第二章 微生物常规鉴定技术 食品微生物检验常用的仪器 培养基和实验室基本操作技术 生物安全实验室 生化实验和血清学实验 生化实验和血清学实验 常见的生化反应原理及现象 血清学试验原理 一、概述 （一）、什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。 （二） 检验细菌的生化试验范围 1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验 3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验 （三）生化试验的方法 在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。 （四）生化试验的注意事项 1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。 二、糖醇类代谢试验 （一）糖醇类发酵试验 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 （三）V-P试验 （四）甲基红（Methyl Red）试验 MR （一） 糖醇类发酵试验 1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解1~2种糖醇 ，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。 常用的糖醇 单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇 2、试验方法： 用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃ 培养1~3天，每天观察结果。 3、结果观察和记录 记录： 产酸不产气，阳性，以“+”表示 产酸产气，阳性，以“⊕”表示 不产酸产气，阴性，以“-”表示 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 　1、原理： 细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。　 2、方法 取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4h天，每天观察结果。 3、结果观察与记录 （三） V-P试验 1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。 2、试验方法 （1）奥梅拉（O’Meara）法 （2）贝立脱（Barritt）氏法 （3）快速法 　　 奥梅拉法： 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 ℃培养48h， 每1ml培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml，摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h ，或在48~50 ℃水浴放置2h后判定结果。 3、结果观察与记录 （1）发酵管出现红色者，为阳性， 记 V-P + （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P - （四）甲基红试验（MR） 1、原理　细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。 2、试验方法： 挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 ℃或30 ℃（以30 ℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。 MR-VP试验原理及照片 3、结果观察与记录 （1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记 MR +； （2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果 复习题 1、什么是生化试验? 2、做生化试验要注意哪些事项？ 3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录 5、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录 （一）靛基质