蛋白质SDS-PAGE电泳.pptVIP

解决办法： 加样前离心 选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液 加增溶试剂 降低凝胶浓度 4 “纹理”现象 样品中的不溶性颗粒引起的 解决办法： 增加溶解度 离心除去不溶性颗粒 5 偏斜现象 电极放置不平行或加样位置偏斜引起 6 带太宽 加样量太多或者加样孔泄露引起 THANK YOU ! * 蛋白质的SDS—PAGE电泳 侯国俊 周希彬 马丽娜 关 欣 1 2 电泳原理 3 电泳中的不正常现象 4 目录 发展历史，分类 样品处理 PAGE胶 发展历史 1967年由Shapiro建立 1969年由Weber和Osborn进一步完善 目前已成为分子生物学实验中常用的一项技术 分类 根据缓冲体系和凝胶孔径的不同： 连续电泳 不连续电泳 根据样品的处理方式不同： 还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳 目前实验室常用不连续的还原SDS垂直电泳 根据电泳形式： 圆盘电泳 垂直电泳 水平电泳 平板电泳 垂直电泳装置 不连续电泳 用浓缩胶（上层胶）和分离胶（下层胶）两种不同浓度，不同PH值的凝胶灌制凝胶板，通过电荷效应，浓缩效应，分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离 样品 样品缓冲液应包含以下部分： SDS（十二烷基磺酸钠） β—巯基乙醇（BME） 溴酚蓝 丙三醇 pH =6.8Tris-glycine SDS 作用： 断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，与蛋白质以一定比例结合，从而使蛋白质带上负电荷并具有相同的质合比，在电泳时迁移速率仅与分子量有关 β—巯基乙醇（BME） 阻止半胱氨酸氧化并打开二硫键 SDS测定的是蛋白质亚基的分子量 溴酚蓝 丙三醇 溴酚蓝是一种染料，能够与蛋白质结合显示蛋白质的运动轨迹 丙三醇的密度比水大，使样品沉淀到加样槽底部 PAGE胶 丙烯酰胺（Acr）:形成聚合物链 甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂，形成纵向桥架 过硫酸铵（AP）：引发剂，产生自由基 N，N，N?，N?—四甲基乙二（TEMED）：催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合 % T = total monomer concentration Acr + Bis total volume X 100% 孔徑平均大小? % acrylamide 孔洞大小决定于 （1）Acr与Bis的总量 （2）Bis的用量：架桥程度 分离胶 浓缩胶 电泳液 三大特色： PH不连续 凝胶浓度不连续 缓冲液成分不连续 ATTENTION: 不同的PH，氯离子，甘氨酸将会在电泳过程中发挥重要作用 工作原理 蛋白质进入分离胶之前，先堆积成一条细线，使每个分子起跑点相同，提高解析度 分离胶内的电泳 按分子量大小进行分离 检测 考马斯亮蓝染色 银染色 考马斯亮蓝 R—250 红蓝色，每个分子含有两个SO3H,偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上 染色结果 银染色 机制： 将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上 应用 蛋白质分子量的测定 蛋白质纯度分析 蛋白质浓度测定 蛋白质水解的分析 免疫沉淀蛋白的鉴定 免疫印记第一步 蛋白质修饰的鉴定 分离和浓缩用于产生抗体的抗原 分离放射性标记的蛋白 电泳过程中的不正常现象 1 “微笑”现象 指示剂前言呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好 2 皱眉现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝胶聚合不完全 3 “拖尾”现象 样品溶解不佳引起 *