不同分化胃癌组差异表达蛋白质的筛选与鉴定.pdf

中文摘要 不同分化胃癌组织差异表达蛋白质的筛选与鉴定 摘 要 目的：胃癌是消化系统最常见的的恶性肿瘤，在我国，其发病率占全 身肿瘤的第二位，死亡率占第三位，虽然给予了以手术为主的综合性治疗， 但患者5年生存率仍未得到显著性提高，有研究表明胃癌的分化程度与患 者生存率密切相关，尤其是低分化胃癌患者预后更差。目前关于胃癌组织 与正常组织之间蛋白质组学研究报道较多，而针对不同分化胃癌差异性蛋 白质的研究较少，寻找及筛选不同分化胃癌之间的特异性差异蛋白质对评 估胃癌恶性程度及其对患者预后分析具有重要意义。本研究拟应用SDS． SDS—PAGE) electrophoresis 聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS．Polyacrylamidegel LC—MS) 技术结合液相质谱联用(Liquidchromatography—massspectrometry 技术，对中高分化与低分化胃腺癌组织中的蛋白质进行筛选，寻找二者差 异蛋白质并对其进行鉴定，以期找到能够反映肿瘤分化程度密切相关蛋 白，为胃癌分化机制及逆转研究提供理论和实验基础，进而通过干预某些 基因或者信号通路(差异蛋白)达到抑制肿瘤细胞分化甚至逆转的目的。 方法： 1收集手术切除后的胃癌标本，从中选取术后病理诊断为中高分化与 低分化典型胃腺癌组织各8例，提取胃腺癌组织可溶性总蛋白，Bradford 方法测定蛋白样品浓度； 2应用SDS。聚丙烯酰氨凝胶电泳技术对样品进行蛋白分离，比较中 高分化与低分化胃腺癌组织的凝胶电泳图谱，找到差异明显的蛋白条带并 切取； 3将筛选出来的差异蛋白条带进行胶内溶解，提取出的蛋白质应用 LC．MS技术进行鉴定，并利用生物信息数据库对蛋白进行功能分析； 4将已鉴定的差异蛋白选取部分蛋白质分别应用实时荧光定量PCR blot)的方法在mRNA水平和蛋白质表 (QPCR)和蛋白质印迹(Western 达水平上进行了验证，检测是否与蛋白质组学检测的结果一致。 结果： 中文摘要 化与低分化人胃腺癌组织蛋白图谱，通过比较得到差异明显的蛋白质电泳 条带15条，切取并进行胶内酶解，酶解后的多肽混合物应用液相色谱质谱 联用(LC．MS)技术，鉴定出355种蛋白质，筛除高丰度以及结构蛋白， 通过生物信息数据软件功能分析确定8种可能与肿瘤分化有关的蛋白质， activator rab．7a， protein RAB7a)、细丝蛋白A(filamin kinase， a，FLNa)、丙酮酸激酶(pyruvate PK)、谷胱甘肽巯基转移酶．冗．1(glutathione 过氧化物酶5(peroxiredoxin protein)。 2选取部分蛋白(人肌动蛋白素、Ras布H关蛋白7a、蛋白酶体激活亚 单位1)在mRNA水平进行验证，应用实时荧光定量PCR，结果显示三种 蛋白在中高分化与低分化胃癌组织中有显著差异(t值分别为一2．600、 ．5．285、4．279，均P0．05)，与蛋白质组学结果一致。 3应用Westernblot技术对人肌动蛋白素、Ras卡H关蛋白7a、蛋白酶体 激活亚单位1在蛋白质水平进行验证，结果显示：与低分化胃癌组织相比， 人肌动蛋白素、Ras相关蛋白7a在中高分化胃癌组织中表达明显降低(t值 结论： l发现不同分化人胃腺癌组织之间差异蛋白8种，证实不同分化程度 的入胃腺癌组织中蛋白质表达存在差异。这些差异蛋白散在在人的胞质蛋 白、核蛋