微生物检测-第6章4梭菌（Clostridium）检查法.pptVIP

第四节 梭菌（Clostridium）检查法 梭菌属有130个种，多数为腐生菌，约有25-30种能引起人和动物致病。这些致病菌能分泌外毒素和侵袭性酶类。临床上的致病性梭菌主要有破伤风梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌等。 梭状芽孢杆菌病 （一）梭菌形态特征Morphological properties 粗大芽孢杆菌，（0.4-1.2）μm ×(3-8)μm，杆状或稍弯曲，单独存在或呈短链状排列。 革兰氏阳性 周生鞭毛 形成的芽孢比菌体宽，在菌体的中央或近端，少数菌种的在菌体顶端，但多数在菌体中部膨大呈梭形。 （二）培养特性 cultural properties 大多数专性厌氧，但耐氧性变化很大 pH6.5-7，30-37 ℃生长快 多数为化能有机型 有的能固氮 触酶试验多为阴性 模式种为丁酸梭菌 对磺胺药、青霉素、土霉素等较为敏感。 （三）检查方法 Test method 1.厌氧培养 冷触媒法： 取适宜容器3个 1个放入氢硼化钠或氢硼化钾0.22g，产氢 1个放柠檬酸0.33g，碳酸氢钠0.37g,产CO2 另一个放活化的钯粒1g，冷催化 临用前与培养管、厌氧指示管一同放入装置中。 取水各5mL加入前两个试剂容器内，立即封闭装置 等厌氧指示管（美兰）达厌氧状态时，移入37℃培养箱培养。 焦性没食子酸法：取适宜容器一个，内装焦性没食子酸10g，无水碳酸钠5g，与已接种的培养管、厌氧指示管一同放入装置中。立即封闭装置，等厌氧指示管达厌氧状态时，移入37℃培养箱培养。 凡士林-石蜡封盖法：在已接种的培养管内注入已经灭菌并液化的1：1的凡士林-石蜡混合物1cm高度，试验管经75-80℃水浴保温时，凡士林-石蜡混合物自动熔化并封住液面，冷却后置37℃培养。在培养过程中可随时取出培养物作检查。 降低培养基的氧化还原电势 添加还原剂：盐酸半胱氨酸、硫乙醇酸钠，甲醛化次硫酸钠，葡萄糖，VC，硫化钠，金属铁，组织等吸收培养基中的氧。 培养基煮沸 添加琼脂：减少对流，防止空气进入 2. 消除杂菌干扰 在做梭菌检查时，常将接种后的液体培养基在75-80℃保温20-30min，以杀灭可能存在的细菌繁殖体。 加入新霉素、卡那霉素、多粘菌素 3.形态学检查 在早期培养时，革兰氏阳性，但24h以上的培养物易染成阴性，因此要注意培养时间 对梭菌属细菌要观察芽孢的存在、位置、形态，革兰染色时，菌体着色，芽孢不着色。 凡经厌氧培养的芽孢杆菌，都是梭菌属，但产气荚膜梭菌、多枝梭菌等难以形成芽孢。 染色未检出芽孢时，进行耐热试验。 二、产气荚膜梭菌（C. perfringens） 普遍存在于土壤、水、食品、调料、肠道中 在食物中生长到每克106个以上才有致病性 ，至少摄取108个以上才可能致病 在肠道中产生芽孢 肠毒素是一种芽孢特异性蛋白，在出芽过程中产生。 （一）生物学特性 1. 形态特征 粗大芽孢杆菌，（0.8-1.0）μm ×(4-8)μm，杆状或稍弯曲，单独存在或呈短链状排列。 革兰氏阳性 无鞭毛不运动 芽孢卵圆形，不膨出菌体，位于菌体中央或次极端 有明显的荚膜 2. 培养特性 厌氧，但要求不严格 在血平板上，产生双圈溶血环，内环（θ）完全溶血，外环（α）不完全溶血，菌落本身略灰黄或灰褐色，与空气接触30min后，可能变为灰绿色或鲜绿色。 一般不形成芽孢，碱性环境易产生芽孢 培养基中有可发酵产酸的糖类时，不形成芽孢 繁殖快，在适宜条件下8min一代 3.生化反应 发酵糖类产酸产气 液化明胶 还原硝酸盐 产生硫化氢 不产生吲哚 代谢产物为酸或醇 Stormy-fermentation 4. 致病性 产生12种外毒素，其中四种为致死毒素。有些毒素本质是酶类。 根据外毒素的种类不同，可将本菌分为A、B、C、D、E 5个型。对人致病的主要是A和C，A常见。 A型菌产生的肠毒素可引起食物中毒，作用类似霍乱肠毒素。 A型菌侵入伤口引起急性坏疽，致死率40-100% C型产生的β毒素可引起急性坏死性肠炎。 (二)产气荚膜梭菌半定量测定 以最大可能数（MPN）法测定菌数 利用乳糖亚硫酸盐培养基和倒管，加入梯度稀释的样品液，混匀后45-46℃厌氧培养24-48h。 试管内有黑色的硫化铁形成同时倒管中有大量气体时，表明有产气荚膜梭菌存在。 查表可知其最大可能数。 （三）特征性生化试验 1. 动力-硝酸盐还原试验： 穿刺接种两管培养基，37℃厌氧培养24h，观察有无动力。检查一管的亚硝酸盐反应，滴加a-萘胺试液及对氨基苯磺酸试液各0.5mL，红色或桔红色表示硝酸盐被还原成亚硝酸盐。梭菌为阳性反应 2.石蕊牛乳试验 Litmus Milk Reactions 产气荚膜梭菌在牛乳培养基中能迅速分解乳糖，产酸，将酪蛋白凝固，产