rnai抑制食癌细胞系eca109端粒酶活性的实验研究.pdfVIP

中文摘要 RNAi抑制食管癌细胞系ECAl09端粒酶活性 的实验研究 摘 要 端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的DNA-蛋白质复 合体结构，有维持染色体稳定和基因组完整的功能，随细胞 的分裂不断缩短，直至染色体丢失、融合、重组和降解，发 生细胞凋亡，因而被称为细胞分裂的“生物钟”。端粒酶是 一种逆转录酶，能以自身的RNA为模板合成端粒的DNA重复 细胞发生永生化或变成癌细胞。端粒酶在85％以上的恶性肿 瘤组织中阳性表达，而在正常体细胞中则一般为阴性。把端 粒酶作为肿瘤治疗的靶点具有良好的应用前景。目前研究认 telomerase 为人端粒酶复合体主要由人端粒酶RNA(human telomerasereverse RNA,hTR)和人端粒酶逆转录酶(human 粒酶活性的最重要部分，也是端粒酶活性的限速因子。因此， 靶向hTERT显然更为理想。其中重要的方法有反义核酸技术 封闭、锤头状核酶切割和抑制hTERT的转录等。RNA干扰 (RNA RNA，dsRNA)引起的转录后基因沉默现 (double．stranded RNase 象。研究表明，Dicer核酸酶(DicerL)断裂dsRNA产 生的小干涉RNA可以抑制哺乳动物体细胞和胚胎中的基因 RNA 的表达。RNA依赖的RNA聚合酶(RNAdependent 中文摘要 活性复制较长触发性dsRNA或以一种非引物的方式复制小 干扰RNA(small interfering 反应。 目的：研究载体介导RNAi技术对食管癌细胞系ECAl09 端粒酶及hTERTmRNA表达的抑制作用，探讨RNAi抑制 肿瘤细胞的作用及机理。 方法：根据Genebank中报道的hTERT的核苷酸序列， AGGTTTCACGCATG T，构建干扰质粒I、II、III及 空质粒，并将其分别转染食管癌细胞系ECAl09，荧光显微 镜观察转染效果；24h、48h末端重复片断扩增．酶联免疫吸 抑制端粒酶活性的hTERT 胞中hTERT mRNA表达改变。 结果：1重组质粒和空质粒酶切鉴定：经BamHI和Hind ⅡI酶切后干扰质粒插入片段为110bp左右，空质粒插入片段 为70bp左右。 2质粒转染细胞24h、48h后荧光显微镜观察各转染组均见 有绿色荧光的细胞，约占细胞总数的50％．60％。 3端粒酶活性测定：干扰质粒I、II、Ⅲ及空质粒转染 ECAl09细胞后端粒酶活性数值：24h端粒酶活性均数依次 中文摘要 各干扰质粒的抑制率：干扰组I抑制率=49％，干扰组II抑制 率=79％，干扰组III抑制率=53％，II组抑制率最高。 4半定量RT-PCR结果 4．1 的宽度及亮度约是18s的2倍左右。 4．2 大小与所设计的大小完全一致，分别为198 bp和621bp，重 扩增产物强度与内对照B-actin的比值在对照组和实验组分 (P0．01，n=4)。实验组降低为对照组的55．4％。 结论：成功构建载体介导的hTERT靶向RNA干扰重组 体，能有效抑制食管癌细胞系ECAl09端粒酶活性及 靶点，为进一步开发抗肿瘤新药和基因治疗提供试验和理论 依据。 人端粒酶逆转录酶；端粒酶 英文摘要 ofRNAionTelomerase InhibitionEffects