酶的生物改造.pptVIP

Myc ds-DNA的富集 * 实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的定向进化 * 　高通量筛选方法的建立 　生物信息学技术手段的建立 　天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造 研究内容及执行情况 * 高通量筛选方法的建立 基于酶联免疫分析方法，选用医用检测试剂盒作为检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合使用96孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法。 建立了改进的可高通量操作的质粒快速检测方法，改进后的质粒快检工作量为原方法的1/3左右，可用于高通量筛选和鉴定所构建的基因工程菌。 * 生物催化的数据整合和信息分析 峰值运算速度达3000亿次/秒的集群系统 基因表达 蛋白质表达 蛋白质-DNA相互作用 蛋白质-蛋白质相互作用 基因和其他功能相互作用 蛋白质定位 网络调节 功能注解 … 生物信息学技术手段的建立 * 天冬氨酸转氨酶热稳定性改造 * 天冬氨酸转氨酶的作用 －－酶法制备L－苯丙氨酸的关键酶 ； L-苯丙氨酸的主要用途 氨基酸输液 L-苯丙氨酸是人体八大必须氨基酸之一，是氨基酸输液的主要成份； 甜味剂的合成 　 由L-苯丙氨酸和L－天冬氨酸合成的阿斯巴甜是二十世纪九十年代以来最受关注的非糖型肽类甜味剂，形成了对L-苯丙氨酸的强烈需求； * 肉桂酸酶法 苯丙酮酸酶法 * 结构分析软件Rasmol 分析酶的三维结构 序列分析软件Clustal W分析酶的一维结构 利用生物信息学技术进行酶结构分析 * 应用DeepView（蛋白质结构预测软件） 确立天冬氨酸转氨酶的热稳定性有关的功能区域 * 引入随机引物，建立突变基因文库 * Compound Library Unique Compound in Each Well Assay Target Plate Reader Same Assay and Target in Each Well Mother Plate Daughter Plate Assay Plate 采用高通量筛选的技术对构建的突变菌库进行筛选 * 筛选 得到酶热稳定性提高的12株菌株 天冬氨酸转氨酶热稳定性的进化 未突变前酶的热稳定性 * 热稳定性定义为55℃下放置10min后酶活性与放置前酶活性的比值 * * Figure 2. The Molecular Breeding directed molecular evolution process. * 有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer) * 有性进化：DNA改组方法 方法：从正突变基因库中分离得到的DNA序列用酶随机切割，得到的随机片断经不加引物的多次PCR循环，获得全长基因，实现优势突变的组合； 特点：遗传变化仅发生在来自不同基因片断之间的 重组，所以称为有性进化； 实例：对内酰胺酶进行DNA改组，3次循环得到的进 化酶对抗生物素头孢噻呜抗性增加32000倍； 优点：将已有的正突变基因结合，正突变效率高； 缺点：无引物PCR之前必须把DNase I去除干净，以 防突变基因的被切割； * 有性进化：体外随机重组法（1998，Arnold) 能以单链DNA为模板，以随机序列引物进行PCR反应，再除去模板，互为模板和引物进行装配和扩增 * 有性进化:交错延伸法（1997，Arnold) 将常规的退火和延伸合并成一步，缩短反应时间 * 基因家族的同源重组 方法：单一酶分子基因进化过程中集中有利突变速度较慢，从自然存在的基因家族出发，由于基因之间存在显著差异，所得突变库体现了基因多样性和增加了有利突变的概率； 实例：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌素的4个同源基因，分别进行单独进化和同源重组，结果单独进化抗性提高8倍、而同源重组比其中2种微生物分别提高270和540倍； 国内海藻糖的酶法制备即采用该方法； 特点：由于定向进化的高效性，被认为是DNA改组的发展方向； * The Molecular Breeding directed molecular evolution process * 对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较，以一 定的标准程序计算出各氨基酸序列的共有序列； 人工合成同序基因后重组表达。 Martin Lehmann等（2000～2002）把这种方法应用在真菌植酸酶家族设计合成了同源植酸酶基因，并表达出具热稳定性的同源植酸酶。 * 外显子改组 真核基因中外显子编码一个折叠结构域，故内含子（转录后被剪切剩下外显子）间的重组，可使独立外显子组装成编码新蛋白质的基因，可导致蛋白质的快速进化； 在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是