红豆杉细胞培养与紫杉醇生产(二)课件.pptVIP

红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究 2.诱导子的添加 植物次生代谢产物的合成具有全能性和多条代谢途径，通过改变培养条件，可以定向诱导目的产物的合成。诱导子是涉及植物与微生物相互作用的生物起源的化合物及引起植物次生代谢途径和强度变化的理化因子，如pH值变化、渗透压、创伤及重金属离子等。近十几年来，利用诱导子提高植物培养细胞中目的产物含量的研究一直是国内外研究的热点。除真菌诱导子外，近年研究较多的是茉莉酸甲酯诱导子、水杨酸诱导子、铜离子诱导子等。 2.1 茉莉酸甲酯诱导子 茉莉酸甲酯(MJ)是近年来引起广泛注意的信号分子，它在细胞的多种逆境反应中起信号介导作用，引起细胞抗逆反应产物的表达对多种次生代谢产物的合成具有诱导作用。 茉莉酸甲酯对培养物中紫杉醇含量的增加具有明显的促进作用，而且对紫杉醇的一系列前体物质及其类似物的含量均有较大影响。 例如：在培养基中加入10μmol/L的MJ,促使细胞培养物紫杉醇含量增加15倍。在WR培养基上添加100μmol/L的MJ,培养的愈伤组织中紫杉醇含量从2.37μg/g增加到90μg/g.Moon等。 实验表明，MJ加入的时间和剂量与紫杉醇的产量有明确的相关性，且以第10~20 d添加200μmol/L，诱导作用显著。对于茉莉酸甲酯诱导产物含量和种类的分析，有助于对紫杉醇代谢途径的研究。 MJ的诱导作用与其他物质一起表现出对紫杉醇产量提高的协同作用。由于MJ诱导作用下，细胞生长和紫杉醇合成之间并不存在明确的相关性，因此可以在发挥MJ对紫杉醇生物合成诱导作用的同时，减少MJ对细胞生长的抑制作用。 2.2水杨酸诱导子 水杨酸作为一种重要的细胞信使与植物抗毒素，可以诱导呼吸方式从细胞色素呼吸途径到交替呼吸途径的转变，为植物病理反应提供物质、能量以及信号传导的基础。红豆杉细胞培养时加入水杨酸可诱导紫杉醇的大量合成。如在适宜浓度的水杨酸诱导下，紫杉醇的产量能够提高3倍左右。 2.3 铜离子诱导子 铜离子可强烈的促进一些次生代谢产物的合成，如促进黄连细胞中的小蘖碱、硬紫草、镇紫草细胞中紫草素和芸苔属植物细胞的吲哚类植保素的合成。CuCl2可作为若干次生代谢产物的非生物诱导子。在悬浮培养中添加CuCl2促进了紫杉醇的形成，其中以红豆杉培养细胞指数生长期末诱导效果最佳。Cu2+浓度效应为最适浓度型，30μmol/L的CuCl2诱导效果最佳。 　诱导中培养细胞的可溶性蛋白质含量、苯丙氨酸解氨酶活性(PAL)及培养基pH值均有变化.细胞内可溶性蛋白质是一些调节酶类，Cu2+诱导处理可能促进细胞内与紫杉醇合成相关的酶的合成。但有关Cu2+促进红豆杉培养细胞中紫杉醇合成的作用机制尚缺少深入的研究。 2.4 酶的代谢调节 由于紫杉醇生物合成涉及到的酶数量较多，大多数酶目前还不明确，也没有成熟的分离鉴定方法。但合成过程中关键酶的研究还是取得了一些进展。 Laskaris等人报道了紫杉醇生物合成途径中诱导酶的存在。在细胞悬浮培养的第7 d时加入茉莉酸酮甲酯诱导物，发现牦牛儿焦鳞酸合成酶活性在头6 h内快速增加，到第5 d时活性达到最高.茉莉酸甲酯诱导了牦牛儿焦鳞酸合成酶的合成,而此酶的增加促进了细胞中紫杉醇的合成和积累，当加入茉莉酸酮甲酯诱导物24h时细胞中紫杉醇开始积累，等到第5 d时紫杉醇积累量达到最大值，这是至今首次发现的紫杉醇合成途径中的诱导酶。 利用细胞色素P450中的氧化酶，能实现紫杉二烯中C-5位的羟基化，该反应也被认为是一个慢速反应。紫杉醇生物合成的起始步骤包括:牛儿基二磷酸环化为taxa-4(5),11(12)-双烯，紧接着细胞色素P450催化C5羧化，乙烯化这个中间产物后，由另一类细胞色素P450催化的C10发生羧化作用，这个生物合成途径紧接着又进行由细胞色素P450介导的加氧反应和辅酶A催化的反应。 试验生成了紫杉醇进行代谢的相关酶系,并把taxane 10β-羧化酶反转录为1 494 bp的cDNA。这个cDNA编码的498氨基的细胞色素P450能催化taxa-乙酸为10β-羧化酶的衍生物,10β-羧化酶标志着紫杉醇生物合成中细胞色素P450起始基因的表达。紫杉醇生物合成的关键步骤就是taxane核心区域多重位点上的氧化反应，这些反应已确定是由依赖细胞色素P450活化的单加氧酶来催化的。对已得到的细胞色素P450羧化酶的底物特异性研究时发现在红豆杉细胞中的紫杉醇生物合成途径不止有一条。 由于植物培养细胞内次生产物是通过多种途径多步酶促反应合成的，对于合成途径中的酶特别是调节酶的研究是进行定向代谢调控，获取最终产物的关键，也是第三代生物工程———代谢工程用于次生代谢物生产的关键。 ３　细胞株的筛选 红豆杉细胞克隆技术 目前红豆杉细胞株系的选择