第七章外源基因的表达分析.ppt

■选择标记基因 a：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。 b：显性选择标记（G418等），可采用各种类型酵母细胞作为宿主细胞。 ■有丝分裂稳定区 来源于酵母染色体着丝粒（centromere）片断，能保证表达载体在酵母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。 ■表达盒 表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号肽序列、多克隆位点及终止子序列。 启动子：保证转录的起始。 分泌信号肽序列：引导目的基因蛋白分泌到细胞外。 多克隆位点：供外源基因插入。 终止子：保证转录在适当位置停止。 （3）酵母基因表达载体的种类 ■自主复制型质粒载体 该质粒含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记、基因克隆位点等关键元件。 酵母基因组DNA复制起始区：能够在酵母细胞中自主复制。 基因克隆位点：来源于大肠杆菌源质粒，如pBR322。 这类载体的优点在于：在酵母细胞中的转化率高，每个细胞拷贝数可达200个 缺点在于：由于缺乏酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过程中不能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细 胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。 ■整合型质粒载体 该质粒载体不含有酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但该质粒含有整合介导区，可以通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，随染色体一起进行复制。 ■着丝粒型质粒载体 该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件（着丝粒），因而能保证质粒载体在细胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提高了质粒在宿主细胞中的稳定性。 ■酵母人工染色体 （4）酵母基因表达系统宿主菌 目前，作为外源基因表达的宿主酵母菌主要包括：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克努维酵母和多形汉森酵母。 （5）在酵母中高效表达外源基因的策略 ■提高表达载体在细胞中的拷贝数 以多拷贝酵母内源性质粒为基础构建的多拷贝表达载体，是提高表达载体在酵母中拷贝数的一个途径。但以上的多拷贝载体在没有选择压力的情况下，可能难以保持其高拷贝数。 将外源基因整合到染色体上可维持外源基因在细胞中的稳定性，然而在多数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其表达。 ■提高外源基因的转录水平 在构建表达载体时组入强启动子，如：酵母磷酸甘油酯激酶基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶基因启动子，可提高外源基因的转录水平。但外源基因表达的产物量过高也会对细胞形成伤害。 ■选择合适的受体细胞系统 根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。 * * 第七章 外源基因的表达 第一节 外源基因在原核细胞中的表达 1.原核生物基因表达的特点 与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点： （1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 （2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。 （3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 （4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 （5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对 基因产物的直接控制要慢。 （6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及16S核糖体RNA 3’ 末端碱基互补的序列，即S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。 2.原核表达系统的注意事项 从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和S-D序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件： （1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。 （2）外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或化学合成 的基因，而不能用基因组DNA。 （3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基的表达。 （4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架。 （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的伤害。 3.原核生物基因表达的调控序列 只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上， 才能够构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效率、高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序 列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、增强子、衰减子等序列。 （1）启动子 启动子(promoter)是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。 原核生物的启动子是由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序列组成。 ■-35区（TTGACA）：位于转录起始位点上游的-35bp附近，是R