第十一章核酸的物理化学性质分析.pptVIP

第十一章 核酸的物理化学性质 核酸的杂交 （二）复性 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。 退火温度＝Tm－25℃ 复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/ 溶液离子强度 将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性 DNA的片段越大，复性越慢 DNA的浓度越大，复性越快 在一定条件下，复性反应的速度用Cot 1/2来衡量，Co为变性DNA复性时的初始浓度，t为时间， Cot ?表示复性一半时的DNA浓度。 两种浓度相同但来源不同的DNA，复性时间的长短与基因组的大小有关 有很多重复序列的DNA复性也快 （三）核酸的杂交 DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 Southern 杂交（Southern bolting） Northern 杂交（Northern bolting） Western 杂交 （Western bolting） 核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。  * * 一.核酸的水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用下形成水解产物。 酸易水解N-糖苷键，嘌呤碱基比嘧啶碱基易被酸水解，脱氧核糖比核糖的糖苷键易水解，DNA的嘌呤碱在pH2以下即脱落而成嘌呤酸。 碱易水解磷酸酯键，RNA在0.3N碱中即被水解，DNA对碱相对稳定。 酶水解 生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。 核酸酶的分类 按底物专一性分：以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。 按作用方式分：核酸外切酶和核酸内切酶。 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。 按作用键分：水解3-磷酸酯键和5-磷酸酯键的核酸酶，产物分别是5-磷酸核苷和3-磷酸核苷 核糖核酸酶举例 牛胰核糖核酸酶（RNase I）,内切酶，水解嘧啶3-磷酸和其他核苷酸5 -OH形成的酯键，产生3 -磷酸核苷。 核糖核酸酶T1，内切酶，发现于米曲霉，水解3 ‘ -鸟苷酸与其他核酸5 ’ -OH形成的酯键，产物为3 ‘ -鸟苷酸为末端的寡核苷酸。 脱氧核糖核酸酶举例 1.牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase I），内切酶，水解DNA 3 ‘ -磷酸酯键，产生5 ’ -磷酸的寡核苷酸，平均长度为4个核苷酸。 2.牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase II），内切酶，水解DNA 5 ‘ -磷酸酯键，产生3 ’-磷酸的寡核苷酸，平均长度为6个。 3.限制性内切酶，可识别特异的碱基序列并水解断开，产物带5 ‘ -磷酸基，已发现数千种，是基因工程的重要工具酶。 N-糖苷酶 水解糖苷键，产物为含氮碱基和无碱基末湍的寡核苷酸 二.核酸的酸碱性质 两性解离：DNA无，只有酸解，碱基被屏蔽（在分子内部形成了氢键）。RNA有两性解离，有pI。核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质 碱基的解离：嘧啶和嘌呤环上的N及各取代基具有结合和释放质子的能力。 核苷的解离：碱基和核糖具有结合和释放质子的能力 核酸的解离：磷酸基具有较强的酸性，核酸的两性解离主要决定于磷酸基和含氮碱基。 三.核酸的紫外吸收 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为