植物原生质体培养与体细胞杂交资料.pptVIP

第七章 植物原生质体培养与体细胞杂交 原生质体概括 原生质体的培养 体细胞杂交 亚原生质体 在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。 核质体:由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。 胞质体:不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。 应用： 1.体细胞杂交（somatic hybridization）：实现远缘物种的体细胞杂交，再通过植株再生就可能创造出新的植物个体 2.遗传转化：实现外源DNA或细胞器的导入，通过植株再生就可以得到转基因植物 3.分离细胞器的理想材料 4.无性系变异及突变体的筛选 植物原生质体研究进展 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培养再生植株。 1985年，Fujimura et al.世界第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养获得再生植株。 二、原生质体培养 （一）原生质体分离与收集 （二）原生质体的培养 （一）原生质体的分离与收集 高产量、高质量的原生质体是进行原生质体培养和操作的前提。 1、材料的选择 1）取材 细胞分裂旺盛的材料 双子叶植物：幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶 单子叶植物（禾本科植物）：愈伤组织或悬浮细胞 2）预处理： 有菌材料，必须进行表面消毒处理； 暗处理； 叶片萎蔫处理，撕去下表皮； 质壁分离处理； 悬浮细胞or愈伤组织预培养。 2、 酶解处理 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质体活力 牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的破坏 pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原生质体的释放量和原生质体的稳定性。 ③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质体的活力和膜稳定性 常用物质：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体用什么浓度，要根据材料的特点来确定。 酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用 ⑵ 酶解 将无菌材料放入酶解液中处理以释放出原生质体的过程 原则：利用尽可能低的酶浓度和酶解时间获得大量而有活力的原始质体 条件：材料与酶解液的比例为1g/10-20ml酶解液；一般在pH5.4 ~ 6.0、25-30℃、黑暗中振荡（30～50r/m）酶解30min~几十hours。 3、原生质体的收集与纯化 ⑴目的：除去未去壁的细胞、细胞碎片、叶绿体、微管成分和细胞团等组织残渣；残余酶液 ⑵预处理：酶解结束后，将酶解物通过孔径为20-70μm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组织块和细胞团，收集滤液于离心管中 ⑶纯化方法： 沉降法：用甘露醇作渗透压调节剂和离心介质，将收集的滤液低速离心，使原生质体沉于管底 漂浮法：用蔗糖作渗透压调节剂和离心介质，将收集的滤液提高速度离心，使原生质体漂浮于溶液表面，细胞碎片等杂质沉于管底 界面法：利用比重不同的溶液，经离心后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间，而细胞碎片等杂质沉于管底。 4、原生质体活力的测定 荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA）染色法 原生质体活力（%）=发荧光的原生质体数/原生质体总数×100% 胞质环流检测法： 以胞质环流作为进行活跃代谢的指标 （二）原生质体培养 1 、培养基 原生质体培养基基本上是参照植物组织或细胞培养所用的培养基。 茄科植物：MS、NT 十字花科和豆科：B5、KM8P 禾本科：MS、N6 、KM8P ⑴无机盐： 大量元素应比愈伤组织培养基中的浓度低； 由于Ca2+影响到膜的稳定性，因此较高『Ca2+』的对原生质体分裂有利。 ⑵有机成分： 原生质体培养时要求培养基丰富的有机成分，如氨基酸、维生素、CM，YE，LH，CH、小牛血清等。 （3）激素： 培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。 ⑷ 渗透压稳定剂： 培养基中必须使用渗透压调节剂，以维持原生质体的稳定。 等渗或者低于细胞内的渗透压 （5）碳源----葡萄糖 ⑴固体培养 （平板培养） 琼脂培养基与原生质体溶液混合摇匀，倒平板，薄层培养。 特点：容易观察、统计原生质体的分裂情况，但操作比较复杂。 进行平板培养时，要注意混合时培养基的温度；平板培养在以后添加新鲜培养基和转移培养物方面也要复杂些。 ⑵液体浅层培养 将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使其成一薄层，封口后进行培养。 特点： 操作简单，对原生质体的损伤小，而且方便以后添加新鲜培养基