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基因工程入门 林陈水 2013年2月 推动生物技术快速发展的，往往是其它学科的技术。 欢迎大家选修本课程！ 联系方法 林陈水 650021 QQ: 529186193 E-mail：lcs999@zjut.edu.cn 网站标题动画 作业1：解说PCR原理的动画（课堂抽查） 作业2：设计用于克隆酶基因的引物（电子版） 作业3：小论文或者动画配音 参考书目关键字 1、分子生物学Molecular Biology； 2、基因工程Genetic Engineering； 3、基因工程药物； 4、PCR/蛋白质纯化； 5、新药开发。 基因工程药物概况 ??? 自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展。1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。 基因工程产品示例1 基因工程产品示例2 生产基因工程药物的基本方法 ? 生产基因工程药物的基本方法是：将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。若目的基因直接在人体组织靶细胞内表达，就成为基因治疗。 生物学中心法则 关于RNAi 基因工程药物的分类 3、激素，如胰岛素、生长激素、心钠素等； 1、 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体； 2、 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子； 4、酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶等。 基因工程药物的优势 1、可以大规模生产，为临床提供有效保障。 2、定点改造，如-S-S-问题；毒副作用问题等。 3、人为制备非天然的药物 4、提供足够多的生理活性物质，进行生理、生化、结构方面的研究，进一步扩大应用范围 基因工程药物研发的困难 1、难以获得正确空间结构的蛋白质。 2、糖基化问题。 3、对宿主有毒性的蛋白质。 基因工程药物的特点 1、蛋白质容易失活、变性；操作时要保持低温、冷冻干燥等；除菌问题 2、容易被蛋白酶降解； 4、通常为注射给药，要求产品纯度高；除菌问题； 3、在一定pH环境下稳定；？！ 制备时通常加入EDTA！ ？！ 基因工程技术 基因工程技术路线 基因工程药物生产流程 上游构建的工程 菌或细胞保存 发酵（通常采用 细胞高密度培养技术） 目标蛋白的纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 制剂 外包装 基因工程药物研发流程 获得目的基因 DNA重组及 工程菌的构建 目标蛋白的表达 （发酵） 建立纯化目标 蛋白的工艺 临床前研究 申请临 床批文 I-II期临床 试生产 批文 III期临床 正式批文 基因工程药物的审批 稳定基因工程细胞(细菌)的构建-------实验室小试-------中试产品-------连续三批产品在自检的基础上送中国药品生物制品检定所检定------临床前研究------所有研究资料送卫生部药品评审中心审查---------申请1—II期临床试验-------试生产------III期临床试验------正式生产。 中试产品的“工程菌”要求 (一)构建的工程细胞表达稳定，一般要传100代以上才能肯定其稳定性。纯化工艺确定之后不能再作改动，要有操作规程和产品的质量指标，如效价、纯度、理化特性等。 中试产品要求的“规模”大小 (二)生产规模不能用使用的发酵罐大小来确定是否是中试产品，要根据基因工程药物的临床使用剂量和疗程来确定。因为不同的药物使用剂量和疗程差异甚大，如INF临床剂量是纳克水平；而tPA的一个剂量需50毫克纯蛋白。又如1FN治疗肝炎的疗程为3—6个月；而Y有的仅能注射一针，一年内不得重复使用等。一般来讲中试产品连续三批要够做临床前研究、全面质量检定和I—II期临床试验用。其总量约需5000个剂量以，这个量对tPA来讲是极为困难的，对其它基因工程药物是很容易达到的。 中试产品要求纯化工艺 (三)纯化工艺简单、不影响产品活性。 临床前安全性研究 安全性（2） 国外没有批准亡市的基因工程药物属一类新药，要按西药一类药的要求做临床前研究，如慢性毒性、药效、药代、生殖毒性等试验。国外已经批准上市的属二类新药，有些试验提供国外资料即可，如药代动力学等。这些临床前安全性试验均要按照卫生部药政局颁布的“临床前研究指导原则”(药学、药理学、毒理学)进行研究，任何离开“指