基因敲除PBL汇报第三小组概述.pptVIP

基因敲除 第三小组成员： 曾明洁、李青林、陈柏岑、 李梓杏、李竞坤、曾小文 基因敲除 基因敲除的概念 基因敲除的基本原理 同源重组的机制 基因敲除技术的新进展 常用的基因敲除小鼠的鉴定方法及其原理 基因敲除的应用及前景 基因敲除的缺陷 基因敲除（DENE KNOCK OUT） 基因敲除：是基因打靶技术的一种 是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。 三部曲：切除（更替）部分-观察整体-推测功能 基因敲除的基本原理 1.完全基因敲除：指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中靶基因活性。 2.条件型基因敲除：指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 完全基因敲除 一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据正—负筛选（positive-negative selection，PNS）原理进行完全基因敲除实验。正向选择基因neo通常被插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，通过同源重组法置换靶基因的功能区。负向选择基因HSV-tk则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长，如果细胞中发生了随机重组 ，负向选择基因就可能被整合到基因组中，导致细胞死亡。 条件型基因敲除 一般是应用Cre/Loxp和FLP/FRT系统所开展的组织特异性敲除，具有可调节性，广受青睐。构建载体时，常将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中 插入方向相同的Loxp位点。当需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交，Cre重组酶就能把两个Loxp位点中间的DNA片段切除，导致靶基因失活。 同源重组（Homologus Recombination) 同源重组是指发生在非姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合 基因敲除技术的新进展 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。 该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。 直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 基因敲除的应用及前景 ①建立生物模型 在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。 ②疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗 通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。 ③提供廉价的异种移植器官 众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α－1，3GT 基因。使每只猪都缺乏产生a１－３半乳糖基转移酶的基因的２个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生。 ④免疫学中的应用 同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。 ⑤改造生物、培育新的生物品种 细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。 基因敲除的缺陷 随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能。其原因包括：一方面，很多基因在功能上是冗余的，敲除一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易的识别的表型。另一方面对于某些必须基因，敲除后会造成细胞致死性，也无法对这些必要的基因进行相应的研究了。 * * 汇报人：曾明洁 2013年11月2日 利用基因同源重组进行基因敲除 利用同源重组构建基因敲除