儿童口腔高毒力形链球菌HtrA缺陷株的构建鉴定及转化力的研究.pdfVIP

二Ο一三年四月 （小三号黑体，加黑，居中） 目 录 （三号黑体，居中） 儿童口腔高毒力变形链球菌 HtrA 缺陷株的构建鉴定及转化 1 力的研究 ……………………………………………………1 1.1 中文摘要………………………………………………………1 1.2 英文摘要………………………………………………………3 1.3 前言……………………………………………………………5 1.4 材料与方法……………………………………………………7 1.5 结果……………………………………………………………12 1.6 讨论……………………………………………………………24 1.7 结论……………………………………………………………30 1.8 参考文献………………………………………………………31 1.9 英汉缩略词对照表……………………………………………35 2 致谢……………………………………………………………36 3 抑制变形链球菌生长的研究进展（综述） …………………………………………………………………39 （四号宋体） 儿童口腔高毒力变形链球菌HtrA 缺陷株的构建鉴定及转化力的 研究 摘 要 （三号黑体，居中） 目的：在前期,本实验组人员已经完成乳牙龋高毒力株筛选及重组质粒载体 pUChtrKO 的构建，本实验要将已筛选出的变形链球菌 HtrA 高毒力菌株复 [1] 苏并在液体培养基 TPY 中增菌制备感受态刺激肽细胞 ，然后再向其中加 [2] 入已经构建完成的重组质粒，通过基因的同源重组 来构建变形链球菌 HtrA 基因缺陷株。并使用细胞生物学、分子学等手段，对变形链球菌 HtrA 缺陷菌株进行进行细菌鉴定，确定为变形链球菌后再通过 PCR 扩增技术来 鉴定以构建完成的细菌是否为变形链球菌 HtrA 缺陷株。最后将以构建完成 的变形链球菌 HtrA 缺陷株和变形链球菌 HtrA 高毒力株经过增菌并系列稀 释后，在红霉素的 TSB 平板上分别培养计数。通常以菌落数的多少，来评 价变形链球菌 HtrA 基因缺陷菌株转化力的高低。从而来判断儿童口腔变形 链球菌的致龋性是否受 HtrA 的调控，如果受它调控就可以为儿童龋病的防 治找到新靶点[3] [4] 。 方法：①构建变形链球菌高毒力株 HtrA 缺陷菌珠：已筛选出的变形链球菌 HtrA 高毒力菌株常规复苏厌氧培养 48 小时，经鉴定为生长良好的变形链 球菌菌落后在液体培养基 TPY 中增菌并制备出感受态刺激肽细胞，然后再 [5] 向其中加入已经构建完成的重组质粒载体 ，通过基因的同源重组进行变 形链球菌高毒力株 HtrA 基因缺陷株的构建。将已经转化的变形链球菌高毒 r 力株经过倍比稀释后吸取 120μl 涂布在含红霉素的 TSA-Eym 固体培养基平 板上，在温度 37℃的条件下进行孵箱培养，大约需要 24～48h，然后挑取 菌落涂片、染色，在显微镜下观察细菌形态进行初步筛选。②变形链球菌 高毒力株 HtrA 缺陷菌株的鉴定:根据 HtrA 的基因序列来设计HtrA 基因的 引物HtrF/HtrR 并进行 PCR 扩增，再以红霉素抗性基因引物P1/P2， HtrA 基因上游引物序列合并红霉素抗性基因引物 HtrAUF/P1, HtrA 基因下游引 物序列合并红霉素抗性基因引物 HtrAUR/P2 进行 PCR 扩增，并将已经进行 了 PCR 扩增的四个基因片段以含有 HtrA 基因的变形链球菌标准株基因组 [