大鼠骨髓基质干胞的分离培养及分化潜能鉴定的实验研究.pdfVIP

中文摘要 目 的 marrow stromal 骨髓中存在一定数量的骨髓基质干细胞(BMSCs，bone stem cells)，这些细胞具有自我复制能力，在特定的诱导条件下能够分化为 中胚层起源的组织，如骨、软骨和脂肪等。将骨髓基质干细胞诱导分化为成 骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，为修复重建由于创伤、感染、肿瘤等各种原 因形成的组织缺损，提供了理想的治疗手段，是一项非常具有应用前景的技 术。 本实验旨在通过对大鼠骨髓基质干细胞进行体外分离、培养，动态观察 BMSCs的生长特点、检测细胞的表面分子抗原；观察在诱导条件下，骨髓基 质干细胞分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力；并通过观察骨髓基质干细胞 对荧光色素Hoechst 33342的排出能力，评价BMSCs所处的不同分化状态， 以期进一步了解骨髓基质干细胞的生物学特性，为其应用于临床提供可靠 的理论依据。 实验方法 1．全骨髓贴壁培养法体外分离、培养大鼠骨髓基质干细胞，倒置相差 显微镜下逐日观察细胞形态及生长状况。 2．免疫细胞化学技术测定细胞表面抗原CD34、CD 表达情况，判定所培养的细胞中有无存在造血细胞和内皮细胞的污染。 3．向生长状态良好的三代细胞中加入成骨细胞诱导液(DMEM培养 液，15％胎牛血清，10mmol／L 坏血酸)培养两周。两周后进行碱性磷酸酶染色和I型胶原免疫细胞化学 染色。 4．当第3代骨髓基质干细胞达到完全融合时，加入脂肪细胞诱导液 DMEM)，逐日观察细胞变化。两周后以油红O染色鉴定诱导后的骨髓基 ·1． 质干细胞。 33342工 5．分别取原代及第5代骨髓基质干细胞，将配制好的Hoechst 作液，加于铺满细胞的培养皿上，避光孵育30分钟，除去染液，PBS冲洗3 33342的着 1荧光相差显微镜观察细胞对荧光色素Hoechst 次，01ympusBX5 色强弱。 实验结果 1．大鼠骨髓基质干细胞的形态学观察：骨髓基质干细胞接种后24h开 始贴壁，随着时间的延长贴壁细胞数量明显增加，呈现梭形或多角形形态， 经换液逐步将培养瓶中不贴壁的杂细胞清除；接种后4～5d可见较明显的 集落形成，集落的形态、大小、密度各不相同；约6～8d，贴壁细胞逐渐融合 成单层，细胞多呈梭形，细胞排列呈现明显的辐射状、漩涡状。 原代培养4～5d时，倒置相差显微镜下可见到聚集成堆，大个、圆形，内 含折光性强的脂滴的脂肪样细胞，油红O检测为阳性。 2．骨髓基质干细胞的表型特征：免疫组织化学技术检测BMSCs的4种 细胞系标记物)表达阴性。 3．定向诱导为成骨细胞：在诱导3～4d后，骨髓基质干细胞逐渐变得 扁平，由细长梭形转变为三角形或多角形；8d时，培养细胞大部分变为多角 形，细胞外基质分泌增多；第14d时，培养细胞之间出现黑色结节样结构。 用钙钴法测定细胞内碱性磷酸酶活性，呈阳性反应；免疫细胞化学显示I型 胶原表达阳性。 4．定向诱导成脂肪细胞：在成脂肪诱导5d，细胞原来的多角形突触逐 渐回缩，但仍呈多角形；7—9d时出现明显脂滴，脂滴多位于细胞边缘。诱导 14d后，脂肪细胞增加，细胞内脂滴密布，多数细胞形态变圆，多散在分布。 油红0染色为阳性。 5．Hoechst 33342染色结果：原代细胞进行Hoechst 33342染色，紫外光 激发后，可