血链球菌细菌素分离、纯化及其化学组成的测定.pdfVIP

中文摘要 刖 置 口腔微生态学研究认为菌斑是引起牙周病的始动因子，菌斑 中存在着牙周可疑致病菌与有益菌之问的动态平衡。近年来研究 发现，血链球菌作为牙周有益菌对牙周可疑致病菌具有拮抗作用， 故目前对该菌在维持口腔生态平衡中的作用机制及开发相应微生 态制剂等方面的研究已成为热点之一。 本实验从赢链球菌培养液中通过羟基磷灰石柱层析、凝胶柱 层析提取出具有抑菌活性的细菌素，并对其成分及其化学组成进 行了研究。此研究可能为今后利用血链球菌的细菌素研制生态制 剂，进行牙周病的生态防治提供依据。 实验材料 1．菌株 血链球菌JFr标准株，具核梭杆菌临床分离株 2．主要培养基 TPY液体培养基，改良GAM培养基 3．主要试剂 G一150，标准分子量蛋白标准品，考 羟基磷灰石，Sephadex 马斯亮兰R一250染色液 4．主要仪器 752C型紫外可见分光光度计，MV—I型垂直板电泳仪，LGJ 一1C冻干机，低温高速离心机，厌氧培养箱 实验方法 1．血链球菌的培养 ·1‘ 将血链球菌JFr标准株接种于5000mlTPY液体培养基中， 厌氧培养48小时，培养液用于提取血链球菌的细菌素。 2．血链球菌细菌素的提纯 (1)血链球菌细胞外蛋白的粗提 将细菌培养液离心后的上清液，加入无水乙醇，再次低温离心 后，收集沉淀，以真空冻干机冻干。 (2)羟基磷灰石(HA)柱层析 一7．2)的磷酸盐缓冲液进行阶梯式梯度洗脱，收集洗脱液。 (3)中空纤维柱超滤脱盐、浓缩 加蒸馏水将各峰的收集液分别反复超滤除盐，直至检测不出 PO。3一为止。浓缩后保存。 (4)Sephadex G一150凝胶柱层析纯化、测分子量 将HA柱层析分离后具有抑菌活性的组分上柱，蒸馏水洗脱。 测分子量时，以标准物分子量的对数对记录仪的走纸长度做 图，得工作曲线。 (5)SDS检测纯度、测亚基分子量 将Sephadex G一150凝胶柱层析纯化后的浓缩液作垂直夹 心板式不连续SDS—PAGE电泳分析。 3．检测样品的抑菌活性 以具核梭杆菌为指示菌，以洞一平板法检测有抑菌活性的组 分。测量孔周围未生长细菌的环的直径来显示样品的细菌素活性。 用二倍系列稀释法配制蛋白溶液，测其最小抑菌浓度。 4．细菌素蛋白含量及糖含量的测定 (1)紫外线吸收法测蛋白含量 测样品280nm处吸光度，得到蛋白浓度，根据牛血清蛋白标 准曲线，计算其蛋白含量。 (2)苯酚一硫酸法测定糖含量 ·2· 测样品490nm处吸光度，得到糖浓度，根据葡萄糖标准曲线 计算其糖含量。 实验结果 1．分离过程及产率 血链球菌培养液经离心，柱层析纯化后，其第Ⅱ峰的蛋白具有 抑菌活性，冻干后得到细菌素，终产率为0．082％。 2．产品纯度的鉴定、分子量测定以及亚基分子量的测定 第Ⅱ峰初产物进一步分离纯化，形成单一对称峰，说明产品较 纯，测得蛋白分子量为180KDa。电泳结果显示为两条区带，分子 量分别为110KDa、70KDa，二者之和恰等于凝胶柱层析测得的分 子量180KDa，说明蛋白含两个亚基。 3．产品抑菌活性的鉴定 第Ⅱ峰蛋白浓缩液具有抑菌作用，lmg／ml可形成直径为 菌环，最小抑菌浓度为62．5ug／ml。 4．细菌素蛋白含量和糖含量的测定 该细菌素为一糖蛋白，其中蛋白含量为87．51％，糖含量为 12．49％。 讨 论 一、血链球菌细菌素的纯化及其组成 本实验在从血链球菌培养液提