BDFACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤_corr_ZYH_20140520资料.docVIP

BD FACSCalibur流式细胞仪 简易操作步骤 一、开机 先打开净化交流稳压电源，其次打开110V稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机。 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色箭头所示）方向调在VENT位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN位置。 二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件 1） 在屏幕下方点击CELLQuest（第四个图标） 启动软件。桌面会出现一’Untitled’ 实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大。 2） 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。 3） 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition and Analysis (收取、分析) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。 4）从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024；如果是双标，Y轴选择：FL2-H 1024(根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明)，如果是单标，Y轴选择：SSC-H。点击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。 说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中， 横坐标X轴和纵坐标Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；双荧光标记时，第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024，X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数， Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。 5） 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）＝（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。 6）从工具板中点击直方图图示，在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。单色荧光只需一个直方图，和第二个散点图一样，横坐标选择FL-1，纵坐标默认为Counts；若是双色荧光，需画2个直方图，一个横坐标选择FL-1-1024，另一个横坐标选择FL-2-1024； 7）在上面直方图中画出M1和M2，其中M1代表隐性数目（一般标示是101），M2代表阳性数目（除M1以外所有的部分）。 8）从Stats菜单中选择Quadrant Stats（象限统计）,5）步骤中的点图将分为四个象限。 三、建立仪器和计算机之间通讯 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer (快捷键Win+b)，此时会出现Acquisition Control 对话方框。 四、仪器设置文件 注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件（Instrument settings），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps -- Threshold -- Compensation。 1） 检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC（根据实验样品确定，一般细胞选择LIN，细菌选择LOG），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。 2）从Cytometer菜单中选择Threshold，出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口：确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。 3）从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。 五、 上样品、设置仪器 使仪器处于High RUN，样品管支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认Acquisition Control