细胞与分子实验操作指南资料.docVIP

中药复方研究室细胞与分子实验操作指南 （2007.10） 目 录 第一章 细胞实验操作 3 第一节 细胞培养常用耗材与设备 3 第二节 无菌操作 3 第三节 培养用品的清洗 5 第四节 培养用品的消毒灭菌及灭菌锅的使用 6 第五节 常用缓冲液、胰蛋白酶消化液及培养基的配制 8 第六节 细胞培养、换液、消化传代 11 第七节 细胞计数 13 第八节 细胞复苏与冻存 15 第九节 MTT法测定细胞活力或细胞增殖 16 第二章 分子实验操作 17 第一节 PCR引物设计与实验操作 17 第二节 Western blot 实验操作 25 第三节 Flow cytometry实验操作 31 第一章 细胞实验操作 细胞培养常用耗材与设备 准备室中常见耗材与设备 去离子水制备器、酸缸、烘箱、高压灭菌锅、储备柜（放置干净未消毒的物品）。 容量瓶（500 ml，1L）、锥形瓶（500 ml，1L）、磁力搅拌器、pH计、电子精密天平、台式离心机、冷冻离心机、涡旋器、普通冰箱（4℃，-20℃）、超低温冰箱（-70℃）。 细胞培养瓶（25mm2，75mm2 ，175mm2）、细胞培养板（96-well，24-well，12-well，6-well）、细胞培养皿（35mm，60mm）、细胞冻存管（2ml，5ml）、离心管（10ml）、移液管（2ml，5ml，10ml）。 移液枪（2.5μl，10μl，100μl，200μl，1000μl，5ml），枪头（10μl，200μl，1ml；颜色分别为：白，黄，蓝），eppendorf管（0.5ml、1.5ml）。 细胞房中常见耗材与设备 超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、倒置显微镜、普通冰箱（4℃，-20℃）。 酒精喷壶（装75%酒精），酒精棉（浓度为75%）、纯酒精（95%，酒精灯使用） 无菌操作 无菌室的打扫与灭菌 定期打扫无菌室：先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰新洁尔灭擦拭。 培养箱定期灭菌：用75%酒精擦拭孵箱内部（最好同时将孵箱中各隔层拆下），再用紫外灯照射。（对于含有自动灭菌程序的孵箱，先用75%酒精擦拭后，再启动其灭菌程序） 实验前细胞房与超净台的灭菌：打开紫外灯，照射30min左右。 每天实验结束后，应及时清理垃圾筒中垃圾。 实验人员的无菌准备 实验前应用肥皂洗手。 穿好实验服，更换拖鞋。 75%酒精消毒双手。 操作台中的无菌操作 在超净台经紫外照射灭菌后，实验人员应注意在通风条件下进行实验操作。 在通风条件下，先点燃酒精灯，再用酒精棉擦拭超净台桌面（尽可能的大于自己所用台面），同时保持工作区域的宽敞。 实验人员应清除无菌区与有菌区的概念。超净台虽经紫外照射除菌，但也是相对的，因此，操作时应靠近酒精灯火焰。 操作时应尽量减少手臂的运动，尽可能避免左右手交叉（近手操作）：把需要有用的工具和试剂尽可能放在手边，以酒精灯为界，左手用的东西放在酒精灯的左边，右手用的东西放在右边。例如，一个右手操作者要从试剂瓶里吸取液体，则移液枪应放在右手，而枪头与试剂瓶都应放在左手边。 带入操作台中的物品，应注意：刚经高压灭菌的可以直接放入超净台中；临时带进来的，应先用75%酒精擦拭或喷洒后再放入超净台，这类物品包括各种装培养基、缓冲盐等的瓶子、试管架、胶塞等。 要养成用镊子操作的习惯：拿取饭盒中的各类物品，尽可能用镊子去夹取；对于小的物品，如瓶盖、枪头、eppendorf管，应避免用手直接去拿取。 打开的瓶子，应放在酒精灯火焰旁，瓶盖反放朝上。禁止在打开试剂瓶包括瓶盖的正上方进行实验操作（包括跨越敞开的开试剂瓶上方去拿取东西）。 实验结束后，依次将个人物品带出超净台（包括废液缸），用酒精棉擦拭桌面，熄灭酒精灯，最后调小风力并关掉日光灯。 废液的处理：先将废液缸中的液体倒入下水道，再将废液缸中其他东西倒入垃圾篓中（尽可能避免将大量废液倒入垃圾篓中）。 其他注意事项 保持试剂瓶与桌面成约45℃时打开盖子或移取液体：这样可以尽量减少空气的污染以及在移液时产生最少的气溶胶。 在打开试剂瓶、拿取瓶盖、镊子及玻璃移液管等时都要用火烧下：灼烧不是为了灭菌，只需在火焰上燎1~3秒即可。灼烧一下瓶口和移液管等，使颗粒固定在表面和制造一个向上的气流，以减少掉落颗粒的数量。 定期检查CO2钢瓶的压力。 定期检查孵箱中水盘中的水量及是否污染（最好每周更换一次，用无菌水） 培养用品的清洗 玻璃器皿的清洗 自来水或肥皂水刷洗。 烘干，泡酸：烤箱中烘干，浸入洗液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）中，浸泡12小时，然后从酸缸捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来