ESAT6-CFP10载体构建.ppt

1 ESAT6、CFP10基因引物设计 ESAT6基因引物（Oligo6.0软件设计，引物设计演示） Upper Primer: 5 GGA ATT CCA TAT GAC AGA GCA GCA GTG 3 Lower Primer: 5 GGG GTA CCT GCG AAC ATC CCA GTG ACG TT 3 ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCATAG 引物设计原则 1 引物长度一般在15~30碱基之间 　　引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 2 引物GC含量在40%~60%间，Tm值最好近72℃ 　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 3 引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配 4 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 发夹结构、二聚体 5 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 6 5′ 端和中间G值应相对较高3′ 端较低 CFP10基因序列引物 Upper Primer: 5 GGG GTA CCG CAG AGA TGA AGA CCG AT 3 Lower Primer: 5 GGA ATT CTC AGA AGC CCA TTT GCG AG 3‘ 保护碱基表.doc ATGGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTACCCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATATTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGTCCTCGCAAATGGGCTTCTGA 2 ESAT6、CFP10目的基因PCR扩增 PCR扩增 PCR扩增目的基因.ppt 反应体系 ESAT6基因 反应体系单位 （μl） ddH2O 30.0 10×buffer 5.0 dNTP 4.0 P1引物 4.0 P2引物 4.0 模板DNA 2.5 DNA聚合酶 0.5 总体积 50 PCR扩增条件 ESAT6基因 96℃ 预变性3 min ； 96℃ 变性45 sec、 62℃退火45 sec、 72℃延伸1 min， 共30次循环 ； 72℃延伸7 min。 电泳 1%-2%琼脂糖凝胶电泳 基因DNA纯化回收（凝胶回收试剂盒） Promega、Takara等 测序及结果分析 分析软件：DNAMan 、DNAStar、BioEdit、ClustalX等（软件使用演示） 3 pET-30a-ESAT6载体构建 载体pET-30a与ESAT6基因双酶切 Double Digestion 双酶切反应 时Universal Buffer 通用缓冲液 的使用表.doc （1）反应体系ESAT6 DNA （2）载体pET-30a ddH2O 24 μl ddH2O 24 μl ESAT6 DNA 17 μl pET-30a 17 μl 10×T 5 μl 10×T 5 μl KpnⅠ 2 μl KpnⅠ 2 μl NdeⅠ 2 μl NdeⅠ 2 μl 总体积 50 μl 总体积 50 μl 按上述反应体系加样，然后将反应管置PCR扩增仪上，37℃酶切2 -3 。 pET-30a质粒和ESAT6双酶切产物的纯化回收 DNA片段回收试剂盒 限制性内切酶酶切位点 EcoR I Kpn I Nde I 连接 （1）连接反应液的配制 ESAT6 酶切纯化产物 4 μl pET-30a酶切纯化产物 1 μl 连接酶