营养05-蛋白质检测分析.pptVIP

蛋白质检测 一、蛋白质测定基础 测定方法： ①利用蛋白质的共性 （即含氮量、肽键和折射率等测定含量。） ②利用蛋白质中特定氨基酸残基、两性（酸、碱）及芳香基团等测定含量。 ③经典凯氏定氮法。（常量、半微量、微量） 具体方法： 古老经典： ①凯氏定氮法 ②双缩脲法（Biuret法） ③Folin－酚试剂法（Lowry法） ④紫外吸收法 新测定法： 考马斯亮蓝法（Bradford法） 蛋白质含量测定方法比较： 思考并讨论：在选择方法时应考虑哪些因素？ ①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间。 二、凯氏定氮法（GB/T14771－2003） 是测定样品总有机氮的最准确、较简便的方法之一。 有机化合物组成：C、H、O、N、S等。 糖类和脂类：C、H、O。 蛋白质：N。 C、H、O、N 特征 16％ 1份N相当于6.25份蛋白质。 通过测定样品中的总氮量再乘以相应的蛋白质系数。 一些蛋白质的含氮量一般为 15%~ 17.6%，有的上下浮动可以测出总氮 N。 凯氏定氮法： 由Kieldhl于1833年 现发展为常量、微量、半微量法、自动定氮仪法及改良凯氏法。 按照国家药品食品监督管理局的规定： 0~3个月婴儿的奶粉，蛋白质含量必须达到12%， 3~6个月婴儿的奶粉，蛋白质含量应不低于10%， 1、原理 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。 1、原理—1消化 1、原理—1消化 2NH2（CH2）2COOH＋13H2SO4 （NH4）2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O 2H2SO4＋C CO2＋SO2＋H2O 3SO2 ＋2N ＋3H2O 2NH3 ＋3SO3 H2SO4＋2NH3 （NH4）2SO4 1、原理—2蒸馏 1、原理—3吸收与滴定 氨用硼酸溶液吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定 吸收：2NH3＋4H2BO3 （NH4）2B4O7＋5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 5H2O＋2HCl 2NH4Cl＋4H3BO3 1、原理—3吸收与滴定 1、原理—3吸收与滴定 指示剂用混合指示剂：亚甲基兰+甲基红。 指示剂 ：红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸） 2、仪器和试剂 仪器： 凯氏烧瓶；可调式电炉；蒸馏装置。 试剂： 硫酸铜； 硫酸钾； 浓硫酸； 40％氢氧化钠溶液； 4％硼酸溶液； 0.1mol/L盐酸标准溶液； 甲基红－次甲基蓝混合指示剂。 3、操作步骤 （1）样品消化 0.5～5g样品＋0.4g硫酸铜＋10g硫酸钾＋20ml浓硫酸 凯氏烧瓶 小火 碳化 无泡沫 溶液呈透明蓝绿色 大火 加热0.5～1h 冷却（400C） ＋水 消化液 冷却室温 3、操作步骤 （2）蒸馏、吸收 吸收瓶： 加入10ml 4％硼酸液＋1～2滴混合指示剂 安装蒸馏装置： 注意密封，吸收管插入吸收瓶 加碱液： 吸10ml消化液，缓慢加入10ml40%氢氧化钠 至溶液变为褐色 加热蒸馏：15min 滴定： 用0.1mol/L盐酸标液 4、结果计算 （V－V0）×0.014×C 蛋白质（％）＝——————————×F×100 m×10/100 式中 V——滴定试样时消耗盐酸标液的体积，ml； V0——空白试验消耗盐酸标液的体积，ml； C——盐酸标液的浓度，mol/l； 0.014——氮的毫摩尔质量，g/mol； m——试样的质量，g； F——氮换算为蛋白质的系数。 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ② 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 ③ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。  ④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度