2014-10 研究生重组DNA技术last.ppt

硕士生学位课程：基因组学 重组DNA技术 检验医学院 周 兰 zhoulan0111@ 本 讲 纲 要 1 重组DNA技术概述 2 重组DNA技术的基本步骤 3 重组DNA技术的进展举例 4 重组DNA技术的应用  1 概述 1-1 概念 1）重组DNA技术：DNA体外拼接 应用酶学方法，将一种生物体的基因与载体有目的地剪、接,重新组合为一个新的、杂合的DNA分子 当其导入另一种生物体（受体）后，能稳定遗传并使受体获得新性状（如：抗药性） 或表达出新产物 （如：大肠杆菌表达人胰岛素） 2）供体、载体和受体 重组DNA技术的三大基本元件 供体：靶基因的提供者 载体：靶基因的交通工具 受体：靶基因扩增、转录和翻译的场所 重组DNA分子： 靶基因与载体以共价键连接所形成的杂合DNA分子 3）与之密切相关的概念 基因工程：重组DNA技术的产业化设计与应用 上游技术：基因的重组和表达的设计与构建 即重组DNA技术 下游技术：基因工程菌(或细胞，生物反应器）的 大规模培养及基因产物的分离纯化等 （1）绕过远缘生物间有性杂交的困难，使基因在动物、植物和微生物之间交流，迅速并定向地获得人们所需的新的生物类型 （2）是基因工程的核心技术，带动现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业 （后详） 1-2 重组DNA技术的开拓者 1)The Recombinant DNA technique was first proposed by Peter Lobban, a graduate student at the Stanford University (Dept. of Biochemistry). Berg（Stanford University，1972）： 用EcoRI切割 SV40DNA 和λphage DNA， 再连接成杂合DNA分子 未证明该体外重组分子具有生物学功能 Paul Berg is awarded the Nobel Prize in chemistry in 1980 for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA. Cohen等的重组实验示意图  2 基本步骤 分/合成：制备目的基因 切:限制酶酶切目的基因和载体 接：连接酶连接2个DNA分子 转：重组子转移到受体细胞 筛：从大量细胞克隆中，筛选出含重组子的克隆 即阳性菌落 鉴：从阳性菌落中提取目的基因， 进一步鉴定其序列正确性 如：PCR扩增来的目的基因是否存在错配 2 基本步骤 2-1 目的基因的获得 2-2 目的基因和载体的酶切 1）限制性内切酶 2）载体 3）酶切时酶的选择原则 2-3 目的基因与载体的连接 2-4 重组子的转化 2-5 重组子的筛选和鉴定 2.1 目的基因的获得 目的基因（靶基因） 拟导入受体细胞进行 扩增或表达的外源基因片段 获取方法 根据对目的基因序列的认识程度等，采用不同的策略 2.1 目的基因的获得 1）聚合酶链反应（PCR) *部分或全部序列已知的基因 *实际工作中常用的方法 不足：可因错配导致目的基因序列的改变 （第35轮复制后的错误概率达0.25%) 2）化学合成法(DNA全自动合成仪) *已知序列的基因可用此法 优点：准确性高，合成速度快 不足：成本高，很少用来合成大片段基因 2.1 目的基因的获得 3）从基因组DNA中直接分离 适用于基因组较小、遗传背景清楚的供体 如：细菌、质粒和病毒DNA等 用限制酶或机械方法断裂待提取的染色体DNA，通过电泳分离所获DNA片段，再用探针从中“钓取”目的基因（Sou