青霉素扩环酶基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达的研究.pdfVIP

中文摘要 青霉素扩环酶基因克隆及在大肠杆菌 中的高效表达研究 摘 要 C，CPC)自从1948 目的：头孢菌素C(Cephalosporin 年被Brotsu发现，以及从礼莱公司在1964年上市第一个头 ’孢菌素头孢噻吩以来，头孢菌素作为一类广谱半合成抗生 素，至今已有60多个上市品种，并已从第一代发展到第四 代。头孢菌素和青霉素都具有p内酰胺特征，不同的是青霉 素母核是由声．内酰胺环和五元噻唑环构成，而头孢菌素母核 则是由肛内酰胺环和六元二氢噻嗪环构成，这种结构上的差 异，使它能抗拒p内酰氨酶(如金黄色葡萄球菌 aureus的争内酰氨酶，但不包括超广谱争内 Staphylococcus 酰胺酶。)的降解。而且头孢菌素具有高效、低毒、抗菌谱 广、过敏反应少、可以口服、品种多等优点。 头孢菌素作为一类广谱半合成抗生素，它可以分为以7一 氨基。3．去乙酰氧基头孢烷酸(7．ADCA)为母核和以7．氨基 系列是青霉素的深加工产品，利用7-ADCA可以合成头孢羟 氨、头孢拉定、头孢克罗、头孢他美酯等头孢菌素类抗生素 药物。由于这些头孢菌素类抗生素可以口服且疗效良好，使 人们不断寻找成功制备这些头孢类抗生素的关键中间体 7．ADCA经济有效的方法。 当前通过青霉素工业盐扩环得到7-ADCA的主要方式是 采用化学法扩环。但化学扩环反应要求有对羟基的“保护”和 中文摘要 “去保护”过程等多步反应，步骤繁琐，自动化水平低，且反 应过程中不可避免的有开环副反应，影响产品收率和质量。 化学法反应条件苛刻，使用大量的有机溶剂(如吡碇)，对 环境造成污染。由于化学法的弊端，使人们在清楚了头孢菌 素的生物合成途径后积极寻找适当的生物工程途径进行扩 环。因此，青霉素扩环酶成为当今工业酶研究中的一大热点。 进行研究，至今扩环酶的研究得到迅速发展。 以棒状链霉菌为来源的扩环酶由于具有潜在的工业应 用价值而得到研究者的极大关注。在九十年代以前，只发现 其以青霉素N作为底物的扩环活性。随着研究的不断深入， 发现扩环酶对青霉素G有很弱的扩环活性。青霉素G作为 一种生物发酵最终产物，可以方便、廉价地获得，所以扩环 酶是否能有效地以青霉素G作为底物扩环产生头孢菌素半 合成重要中间体7．ADCA，并进行工业化生产成为人们研究 的焦点。 ’ 本研究的目的是：1．克隆棒状链霉菌的扩环酶基因，构 建高表达的原核载体。2．在原核细胞中表达扩环酶，建立扩 环酶的高效表达平台。3．以青霉素G为底物建立扩环酶活 性检测体系。4．进行扩环酶结构的改造，探索其工业化生产 的可能性。 方法 1．扩环酶基因克隆及原核表达工程菌的构建 以从Streptomyces 典型菌种培养物保藏中心)抽提得到的基因组DNA为模板， 利用PCR方法扩增得到扩环酶基因片段。将获得的PCR片 中文摘要 easy载体中获得插入扩环酶基因的质粒 段连接到pGEM．T pGEM-Teasy／cefE。 由于扩环酶的底物是p内酰胺类物质，为了避免将来在 扩环酶表达产物中含有p内酰胺类物质，将质粒pET-3b中 Ampicillin抗性基因替换成kanamycin抗性基因。 用NdeI和BamHI酶切质粒pGEM—Teasy／cefE，将得到 载体pET3b／Kan中。 ’ 表达菌株。． 2．扩环酶基因的表达纯化以及活性的检测 用IPTG诱导表达后，收集菌体超声裂解破碎细胞，使 之释放出可溶性的扩环酶蛋白，并离心获上清液，将得到的 上清液作为粗酶反应液进行活性检测。 在反应体系中按照顺序分别加入扩环酶扩环活性所必