球虫DNA及RNA提取方法汇总解析.docVIP

粪便中卵囊的收集和纯化 简介 球虫感染鸡后，在宿主体内经裂殖生殖、配子生殖后形成带有卵囊壁的未孢子化卵囊，随粪便排出体外。粪便中的卵囊由于密度小于饱和盐水，因而可以被后者漂浮起来；而卵囊的密度又大于稀释的盐水溶液，故而可以从稀释的盐水中沉淀下来。根据此原理，利用饱和盐水漂浮粪便中的卵囊，然后将含卵囊的饱和盐水用水稀释后离心沉淀，即可将卵囊从粪便中分离和纯化。 材料 塑料盆若干个（视所收集的粪便量而定） 80目（60目、100目也可）和160目（或者180目）金属筛各一个 搅拌用塑胶软铲一个 不锈钢铲子一个 1L塑料烧杯1-3个，100ml、500 ml塑料烧杯各一个 离心罐（低速大容量离心机因平衡需要，需在任何离心时将6个罐平衡后全部放到支架上） 报纸若干张 尖头吸管 玻璃棒（粗）或药品勺（不锈钢制） 吹气软管 （以上物品需在烤箱中80℃烘烤2h后使用） 秤（婴儿秤）一台 电子天平（普通天平也可）一台 吹气设备 饱和盐水（自来水加入过量食盐煮沸，冷却后分装至塑料桶或500 ml瓶中，注意防冬天温度过低造成盐水不饱和） 2.5% 重铬酸钾溶液 步骤 用塑料盆收集接种后6.5-8天的粪便（本时间选取是针对柔嫩艾美耳球虫的，其他虫种请查阅文献，确定收集时间），搅拌均匀（若鸡只数目少，应在6.5天时在粪便收集盘中洒一些重铬酸钾溶液以保持粪便湿润），称重； 称取2g粪便至塑料小烧杯中，加入60ml饱和盐水，搅拌均匀，充入改良麦克马氏板记数室，静止3min后在显微镜下计数；计算粪便的OPG（计数所的读数×200），估算粪便中卵囊总数； 将粪便中加入5-10倍体积的自来水，搅拌均匀，然后用80目筛子进行过滤；此过程中需用塑胶软铲不停搅动，使大部分的水溶液滤过筛网，收集至一塑料盆；滤后的粪渣置于另一塑料盆； 粪渣再加入自来水，如步骤3过滤；此过程重复2次（针对粪便量少者，可以增加一次以提高卵囊收集率），最后弃去粪渣； 将所有的滤过液用160目的筛子进行二次过滤，滤液收集至塑料盆中； 滤液静止3h或更长（不宜过夜，长时间浸泡对卵囊活力有影响；需过夜再继续操作者，应在滤液中添加重铬酸钾，至浓度在1-2.5%），然后快速倾去大部分上清（动作既快又稳，小心不得将沉淀倒掉）； 将所得到的混悬液离心（3000rpm，8-10min或3600rpm，5min；以下离心均采用此设置），收集所有沉淀； 用玻棒搅匀沉淀，加入少许饱和盐水，搅匀，再次添加并搅拌，至形成均匀的混悬液（一般加入的饱和盐水的体积为粪便沉淀的5倍，采用步骤10（2）时可以将加至离心罐容积上限）； 离心漂浮卵囊； （后续的操作步骤10有两种，粪便沉淀量少者可采用第一种10（1），量大者可采取第二种10（2）） （1） 所得的含卵囊上清倒入一个大烧杯中，重复步骤8，离心后同样将上清收集至烧杯；并再重复一次，合并3次所得上清；将上清均匀分配至离心罐中，加入至少3倍体积的自来水，然后离心沉淀卵囊； (2) 用尖头吸管吸取上清表层漂浮的卵囊，所吸液体收集于一个烧杯中；至表层大部分卵囊漂浮物被吸走后，将剩余上清转移至另一大烧杯；沉淀搅匀后，倒回转移的饱和盐水，少量多次并搅拌，同步骤8，可补加盐水以弥补上清吸取转移走的盐水；如此再重复2次，合并3次所吸取的表层卵囊溶液，加入至少3倍体积的自来水，然后离心沉淀卵囊； 所得卵囊沉淀因含有大量粪便等杂质，需再次用饱和盐水离心漂浮一次（若卵囊数量少于1千万，此步骤推荐用50ml离心管进行操作，以免丢失过多）；随后离心沉淀； 两次漂浮沉淀后得到的卵囊沉淀用重铬酸钾溶液重悬，转移至小锥形瓶或盐水瓶中（重铬酸钾的体积根据卵囊的数量决定，每毫升所含卵囊不得超过100万，但可以多加）； 接好吹气装置，置于28℃温箱或自制孵化箱中通气孢子化，时间为48小时（注意24h时添加水，补偿吹气孵化所蒸发的水）；孢子化完毕，将卵囊做好标记保存于4℃； 做好善后事宜，如操作台和离心机的清洁、所用物品的清洁与归位、鸡只的剖杀与笼具的清洗等。 （刘贤勇 整理） 球虫基因组从田间样品中的提取 1、试剂 卵囊裂解缓冲液：20 mM（毫摩每升） Tris-HCI, pH8.0；100 mM EDTA and 1% SDS 0.5M EDTA（pH8.0）：在 800ml 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节溶液 pH 至 8.0（约需 20gNaOH 颗粒），然后定容至 1L，高压灭菌。 1M Tris-HCl：将 121.1g Tris 碱溶于 800ml 蒸馏水中，用盐酸调 pH 值至 8.0（约需 42 ml浓盐酸），定容至 1000ml，高压灭菌。 10% SDS：量取电泳