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核酸杂交及其他技术 第一节 核酸分子探针的标记 一、探针的定义及类型 核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作用的DNA或RNA片段。 根据来源和性质不同 1. 基因组DNA探针 优点：可来源于克隆化的各种基因，容易获得。 缺点：需要避免使用真核生物基因组中存在内含子及非编码序列，否则可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性结果。 2. cDNA探针 优点：不存在内含子及其它高度重复序列，特异性高。 缺点：需要以mRNA为模板，逆转录为cDNA，不易获得，还需注意poly（dT）可产生非特异性杂交。 3. RNA探针 优点： 稳定性高（RNA/RNA或RNA/DNA）、特异性强（杂交条件更为严格）、效率高（不存在互补双链的竞争性结合）。 不存在高度重复序列，非特异性杂交少。 杂交后可用RNase将未杂交的探针分子消化掉，从而使本底降低。 是一种较为理想的探针。 缺点：RNA极易降解，不易操作；有poly（A）尾，有时会影响特异性，但可克服（在杂交液中加入PolyA封闭待测核酸序列中可能存在的PolyT或PolyU）。 4. 寡核苷酸探针 优点：可随心所欲合成需要的探针（大多数为15-30bp)，可用于基因点突变分析（一个碱基不配对也会影响其溶解温度），杂交所需时间短（序列的复杂性降低）。 缺点：灵敏度较低（探针所带标记物较少） 设计寡核苷酸探针的原则（根据已知核酸序列） 1、探针长度一般要求为10-50bp 2、G+C含量应为40-60% 3、不应有大于4bp的反向互补配对，避免形成发夹结构 4、避免有同一碱基的连续出现 5、在计算机上进行同源性比较（大于70%或连续有8个碱基相同时最好不用） 二、探针的标记物 理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、探针保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。 （一）放射性标记物 （二）非放射性标记物 （一）? 放射性标记物 放射性核素 利用放射性核素能产生射线的特性将核素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA 或RNA 中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的?或?射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。 产生?射线的核素：32P、3H、35S 产生?射线的核素：125I 1、常用的放射性核素 （1）32P：产生穿透力强的?射线，放射自显影所需时间短，灵敏度高，是最常用的放射性标记物，但半衰期短（14.3天），射线散射严重。多采用?位和?位标记dNTP或NTP。 （2）35S：射线散射作用弱，分辨率高、半衰期长（87.1天），但释放的?射线穿透力弱，灵敏度低。 O(S) O(S) O(S) OH- P-O-P-O-P-O-CH2 O 硷基 O O O H H(OH) 2、放射性标记物的优缺点 优点：灵敏度高：0.01pg 特异性强 缺点：放射性污染 成本高、半衰期短，不能长期保存 （二）非放射性标记物 1、优缺点 优点：无放射性污染 成本低、操作简单 稳定性好，可长期存放 缺点：敏感性、特异性均略低于放射性核素 2、常用的标记物 （1）生物素：1-2pg 生物素化核苷酸：bio-16-dUTP bio-11-dUTP 生物素化核苷酸通过酶促反应掺入到DNA中去制成探针杂交抗生物素蛋白-生物素-酶的复合物加底物显色 光敏生物素：生物素与光敏基团结合光敏生物素光敏生物素与核酸探针混合在强光的作用下光敏基团与核酸共价结合生物素标记的探针 生物素化的核苷酸和光敏生物素 （2）地高辛甙元 Dig-dUTP通过酶促反应掺入到DNA中去制成探针 杂交加抗地高辛-酶的复合物加底物显色 灵敏度较高：0.1pg 特异性较生物素高 是较理想的非放射性标记物 三、探针的标记方法 体内标记法 体外标记法 （一）化学标记法 光敏生物素的标记 生物素-补骨脂（Biotin-psoralen） 补骨脂素是一种光敏物质，与生物素连接成为生物素-补骨脂素。 补骨脂素在紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应，加入到待标记的DNA中，得到生物素标记核酸探针。 可标记ssDNA/dsDNA/RNA/寡核