乳铁蛋白双抗夹ELISA的建立及检测对于干眼诊断价值的研究.pdfVIP

中文摘要 乳铁蛋白双抗夹心ELISA的 建立及检测对于干眼诊断价值的研究 专 业：眼科学 硕士生：虞东芳 导 师：刘祖国教授 中文摘要 干眼是目前最常见的眼表疾病，是指各种原因引起的泪液质和量或者泪液 动力学异常，导致泪膜不稳定和眼表组织损害，并伴有眼部不适症状的一类疾病 的总称。干眼的瘸因复杂，症状多样，严重影响着人们的生活质量。但目前国内 外缺乏统一、简单、客观的干眼的诊断标准， 因此寻找这样的诊断标准以使疾 病得到及时正确的治疗已成为现今跟科临床研究的重要课题之一。 泪液乳铁蛋白(1actoferrin，LF)是泪液中由浆液腺产生的最主要的抗菌蛋白 质，是人眼防御系统的重要组分。泪液乳铁蛋自主要来源于泪腺和副泪腺的腺泡 上皮细胞，其含量在很大程度上能反映泪腺的外分泌功能，对于评估眼表的健康 状态具有重要价值。许多研究表明泪液乳铁蛋白含量降低可能是诊断干眼最敏感 特异的客观指标。 本课题透过应用新一代噬菌体抗体库技术，以基因工程的方法制备抗乳铁蛋 chainvariable 白的单链抗体(Single fragment，ScFv)，作为包被抗体。同 antibody， 时以免疫动物的方法制备抗乳铁蛋白的多克隆抗体(Polyclonal peroxidase，HRP)标记作为酶标抗 PcAb)，并利用辣根过氧化酶(Hoeseradish 体，从而建立乳铁蛋白的双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(Enzyme—linked immunosorbentELISA)。用于检测泪液中的乳铁蛋白含量，分析其对于 assay， 干眼的诊断价值，以期制定客观的实验室标准协助干眼的诊断，并且抗乳铁蛋自 抗体的获得为进一步制备免疫组织化学试剂、胶体金标记试剂提供了基础。 lI 中文摘要 SoFv的制备及鉴定 第一部分抗LF l研究方法 1．1 抗LF噬菌体抗体的筛选及分泌型表达：将LF抗原行固相化，从已构 建好的噬菌体抗体库中筛选抗LF的噬菌体抗体。将其转染大肠杆菌HB2151进行 分泌型表达，并对表达条件进行优化，ELISA方法鉴定噬菌体抗体和表达产物。 1．2抗LFScFv的纯化及鉴定：利用固相金属鏊合层析法从经饱和硫酸铵 沉淀的培养上清中纯化出抗LFScFv，并对纯化单链抗体的性能以ELISA和 SDS方法对其纯度及反应性能进行初步鉴定，Bradford法定量所得抗体。 1．3噬菌粒载体的提取：按常规质粒提取法提取选定菌株的质粒，对其进 行序列测定，分析抗体重链可变区、轻链可变区及接头序列。 2研究结果 2．1 经过4轮筛选和富集，制各的单菌落噬菌体抗体及感染HB2151表达产 物均为阳性。优化表达条件时加入0．2mm蔗糖及lmmlPTG者抗体表达产量最高。 2．2纯化后的抗LFScFv达电泳纯，抗体产量达2．4mg／L。间接ELISA示 其与BSA、转铁蛋白、溶菌酶无交叉反应。 2．3测序结粜表明，抗LF ScFv基因包括重链可变区(VH,354bp)、接头 3结论 本部分通过运用噬菌体抗体库技术制备了抗LFScFv，抗体纯度高、特异性 强，可用于进一步制备ELISA或组织免疫化学等检测试剂盒，分析LF在泪液的 含量及跟部组织的分布，不仅有助于干脆诊断及疗效翔定，也有助于了解多种眼 部疾病及全身病的病理生理、协助诊断、评估预后等，具有非常重要的临床意义。 第二部分抗LFPcAb的制备及鉴定 1研究方法 1．1动物免疫及抗血清的制备：选取健康成年雄性家兔，以弗氏完全佐剂 与LF抗原作基础免疫。之后每隔两周以弗氏不完全佐剂与L