PRRSV河南株ORF7基因的克隆表达及其N蛋白免疫原性分析.pdfVIP

摘要 摘要 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弓l起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)严重 危害全球养猪业。PRRSV现分为欧洲型和美洲型两个基因型，两型毒株之间基 因差异大，美洲型毒株之间的基因差异更大。PRRSV基因型的存在和基因的多 变性，给临床诊断和疫苗研发应用提出了挑战。核衣壳蛋白N蛋白由ORF7编 码，美洲型与欧洲型毒株N蛋白各含123和128个氨基酸，N蛋白在全病毒中 含量最高，免疫原性最强，是病毒感染后最早诱导产生特异性非中和抗体的蛋 白。因此，PRRSVN蛋白在病毒的早期诊断和致病免疫机理研究中具有重要意 义。 为了快速诊断和检测PRRSV，研究了应用RT-PCR和基因测序技术快速检 测PRRSV是否美洲型和高致病性变异株的分子诊断方法。根据参考株IAF．exp91 和LV ORF7基因序列设计出2对引物，引物S1R1是一对特异性引物，它只能 扩增美洲型PRRSV基因序列，不能扩增欧洲型PRRSV基因序列；引物$2R2 可以扩增美洲型和欧洲型的PRRSV序列。用两对引物扩增两河南分离株PRRSV HN07．1和HN07．2，发现两引物均克隆出了相对应的碱基序列，并且ORF7基 因的长度均为372bp，编码123个氨基酸，测定的序列完全相同。进而用DNAStar ORF7 软件对两河南分离株的ORF7序列与在GenBank上选取的24株PRRSV 序列进行比较分析。结果显示，本试验克隆的ORF7序列与三株欧洲型PRRSV ORF7序列同源性 ORF7序列的同源性在65．1“6．9％之间，与美洲型PRRSV 达99．7％。根据高致病性PRRSV Nsp2基因的缺失信息设计并合成了3条引物， 217bp的碱基序列。对病毒核酸的检测与分析结果表明，PRRSV河南分离株 HN07—1和HN07．2均属于美洲型毒株且都是高致病性PRRSV变异株。 为了给PRRSV地方分离株N蛋白的研究与应用提供物质基础，本研究首先 的原核重组表达质粒pGEX．6p．1．N及其表达菌，成功进行了重组N蛋白的可溶 摘要 性表达，并获得其优化表达的条件参数和表达蛋白的纯化方法。对所表达纯化 的N蛋白的免疫原性进行了检测与分析。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；非结构蛋白；结构蛋白；克隆；原核表达； 检测 Ⅱ Abstract Abstract Porcine and iscaused Respiratory Reproductive Syndrome(PRRS)whichby Porcine and ReproductiveRespiratorySyndrome damages Virus(PRRSV)deeply swine includstwo andAmerican global industry．PRRSV type genostypes：European variationbetweenthetwo is betweenthe type．Thegenetic genotypeshigh，especiall