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基因诊断 学院：环资学院 作者：毛新伟 学号：2013116011006 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断 一.概念 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 DNA诊断 RNA诊断 二、 基因诊断的应用 遗传病 产前诊断、优生优育 肿瘤 了解恶性肿瘤的分子机制，对肿瘤分类分型及预后有指导意义。 感染性疾病 具有快速、灵敏、特异等优点 法医学中个体识别、亲子鉴定 有些具有个体特征的遗传标记可用于个体识别和亲子鉴定，如DNA指纹分析、短串联重复STR）多态性分析等。 二、基因诊断的特点 针对性强： 以探测疾病基因为目标，属于“病因诊断” 。 特异性高： 以分子杂交技术为基本原理 灵敏度高： 基因探针带有十分敏感的检测标记，可从人 类长达3×106kb的基因组中检测出某一基因的 单碱基改变。而且待测标本微量。 适应性强： 基因探针可为任何来源，任何种类，探针序 列可为已知亦可未知，检测目标可为内源基 因亦可外源基因，诊断范围广。 安全高效、适应范围广、早期诊断、取样方便等 样品抽提 PCR扩增 分子杂交 杂交信号检测 DNA RNA cDNA 三.基因诊断的基本流程 四、基因诊断的基本技术 核酸分子杂交 PCR 限制性片段长度多态性分析(RFLP) DNA序列测定 DNA芯片技术 1、核酸分子杂交（hybridization） 这是应用最广泛的一类基因诊断技术 根据碱基互补配对原则，将样品DNA/RNA双链经变性处理，加入已标记的单链DNA/RNA探针，样品中与探针互补的DNA/RNA序列可与探针形成杂交双链DNA，通过显示标记物或其它方法来检测特定的核酸片段。 杂交 分离、变性、转移、固化DNA片段 标记核酸探针 制备待测核酸样品 制备核酸探针 分子杂交操作程序 预杂交 加入标记核酸探针 漂洗除去未参与杂交的标记探针 检测杂交信号 分子杂交的基本方法 原位杂交 斑点印迹杂交 Southern 印迹杂交 Northern 印迹杂交 2、PCR技术 基本原理－DNA复制 三个步骤 变性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(extension) PCR技术让Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链 加热使模板DNA 在高温下90- 95 ℃变性，双链解链 降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链 PCR的基本反应步骤 3、限制性片段长度多态性（RFLP）: 限制性核酸内切酶能够识别特定的DNA序列，并在其中的某一特定碱基位点（限制性位点）将DNA切断，使 DNA形成限制性片段. 粘性切口 平端切口 RFLP技术珍断疾病的机理: 由于基因突变的结果,使DNA上原有的核酸内切酶的识别序列发生改变,导致使用限制酶去切割时得到的结果与不发生突变的结果完全不同,可借此做出诊断. 如:某些遗传性疾病发生特异的点突变,而点突变位置正好是某些酶的识别和切割点,可用酶切方法做出诊断. 基因芯片(Gene chip, DNA chip),又称为DNA微阵列(DNA Microarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将已知DNA片段或cDNA片段作为探针，紧密有序地排列固定于支持物（多聚赖氨酸硅胶）上，然后与荧光标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，获取样品分子的数量和序列信息。 4、基因芯片 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern?、northern）是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行