核酸的物理化学性质.pptVIP

一、核酸的水解 （一）酸或碱水解 （二）酶水解 3、根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶 1）核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸； 2）核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。 4、常用核酸酶 1）核糖核酸酶 牛胰核糖核酸酶（简称RNaseⅠ，其作用点为3’－嘧啶核苷酸与其它核苷酸之间的连键，产物为3’－嘧啶核苷酸或以3’－嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸）； 核糖核酸酶T1（其有比RNaseⅠ更高的专一性，它的作用点为3’－鸟苷酸与其相邻核苷酸的5‘－OH之间的连键，产物为3’－鸟苷酸或以3’－鸟苷酸为结尾的寡核苷酸）； 核糖核酸酶T2（其作用位点为Ap残基，可以将tRNA完全降解为3’－腺苷酸结尾的寡核苷酸)。 2）脱氧核糖核酸酶 （1）牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ），此酶断开双链DNA或单链DNA成为5’－磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度为4个核苷酸； （2）牛脾脱氧核糖核酸酶（ DNase Ⅱ），此酶只降解DNA成为3’－磷酸末端的寡核苷酸，平均长度为6核苷酸; （3）链球菌脱氧核糖核酸酶，其只作用于DNA，产物为5’－磷酸为末端的碎片，其长度不一，需Mg2+。 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收 1、原理： 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240－290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。 2）确定所提取的核酸是否纯品。 3）判断DNA制剂是否发生变形或降解 四、核酸的变性、复性及杂交 （一）DNA变性 1、概念：它是指 DNA 双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。 如多核苷酸骨架上共价键断裂则称为核酸的降解，降解可使核酸相对分子量降低。 1）核酸变性后形态的改变 双螺旋DNA和具双螺旋区的RNA氢键断裂，空间结构被破坏，形成单链无规则线团状的过程。 2）结果： A、增色效应：260nm紫外吸收增加； B、粘度下降、浮力密度上升； C、生物学性能部分或全部丧失。 3）引起变性的因素： 温度、pH、尿素（测定DNA序列时常用的变性剂）、甲醛（测定RNA分子大小时常用的变性剂）等。 2、核酸变性示例——热变性与Tm 1）Tm定义：当DNA的稀盐溶液加热到80～100度时，双螺旋结构解体，形成无规则线团，研究发现，DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内，有一个相变的过程，通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度（melting temperature), 用Tm表示。DNA的Tm一般在82－95°C之间。 2）DNA Tm值的影响因素 （1）DNA的均一性 均质DNA如一些病毒的DNA，人工合成的多聚腺嘌呤－胸腺嘧啶脱氧核苷酸熔解过程发生在一个较小的温度范围之内，异质DNA熔解的过程发生在一个较宽的温度范围之内，所以Tm值可作为衡量DNA样品均一性的标准。 （2）G-C的含量 在pH7.0,0.165mol/L NaCl中DNA的Tm值与G－C含量之间有正比关系，G－C对含量越多，Tm值越高，这是因为G－C对之间有3个氢键，所以含G－C对多的DNA分子更为稳定，因此，测定Tm 值，可以推算出DNA的碱基的百分组成，经验公式为： xG＋C=(Tm－69.3）×2.44，同样也可从DNA的G＋C含量来计算出Tm的值。 （3）介质中的离子强度 一般说离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，而且熔解温度的范围较宽，而在较高的离子强度时，DNA的Tm较高，而且熔解过程发生在一个较小的温度范围之内，所以DNA制品不应保存在极稀的电解质溶液之中，一般在含盐缓冲溶液中保存较为稳定。 （二）RNA的变性 （二）复性 1、概念： 变性DNA在适当条件下（缓慢降温），可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的过程。复性后，许多物化性质可得到恢复，生物学活性部分恢复。 （三）核酸的杂交（hybridization） 1、概念：将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA。DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。 2 、应用 2）在分子生物学和遗传学中的应用 1、制备探针（probe)，用于疾病诊断 1）概念：一小段（十几至数百）多聚核苷酸单链用 32P、3