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(一)基本原理和程序 噬菌体抗体库技术的原理，简言之就是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，就可以方便地利用抗原—抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，则可获得可溶性的抗体片段。在建库过程中如果将VH和VI。随机组合，则可建成组合抗体文库；如果抗体mRNA来源于未经免疫的正常人，则可以在不需要细胞融合的情况下建立起人天然抗体库。 动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序 （1）澄清和沉淀处理： 1000g 离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质）→ 20 000g 高速离心30min ,去除残留的小颗粒物质 → 用0.2 μm微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体 → 饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱和硫酸铵能回收90%以上的抗体）。 单抗纯化 （2）分离 A、凝胶过滤：用于IgG和IgM类。常用SephadexG200 为离介质，收集到3个峰，最高峰为IgM，另外两个峰为 IgG。抗体回收率达50~80%，能去除微量杂蛋白，纯度达95%以上。 B、阴粒子交换层析：用于IgG类。在pH7.4条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低粒子强度下洗脱下来，其纯度很高。 IgG2b和IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。 C、亲和层析：多用蛋白A亲和层析，适用于IgG类。鼠源性单抗在 pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合在蛋白 A柱上，IgG1稍差，用 pH3.5缓冲液可洗脱 IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱IgG2a， pH6.0可洗脱IgG1。收获的抗体纯度很高，但也有极微量的杂蛋白。 单抗纯化 第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。 目的：降低免疫原性；降低相对分子量，增加组织通透性。 单抗改造 Ig分子结构 单抗改造 原理：抗体同抗原结 合的功能决定于抗体 分子的可变区（V）， 同种性免疫原性则决 定于抗体分子的稳定 区（C）。 一、人鼠嵌合抗体（chimeric antibody） 在基因水平上将鼠源单抗的可变区（V）与 人抗体的稳定区（C）融合而得到的抗体。 单抗改造 构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体稳定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。 单抗改造 构建重组表达载体 克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。 人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。 人-鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，加强ADCC效应。目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。 单抗改造 ADCC效应 即抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。其机制为靶细胞膜抗原与特异性IgG类抗体结合形成免疫复合物后，IgG抗体的Fc段与效应细胞(如NK细胞、巨噬细胞)上的Fc受体结合，使效应细胞活化，产生对靶细胞的杀伤作用。 单抗改造 鼠单抗可变区的人源化 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。 单抗改造 二、改形抗体（CDR移植抗体） ( Reshaping antibody ) Ig 分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。 用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。 单抗改造 CDR区 三、小分子抗体 基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段，相对分子量为原抗体的1/80～1/3。即保留CDR区，而Ig 分子中的C区不表达。 小分子抗体类型有 　①Fab片段抗体： VH+CH1 　 ②Fv抗体： V