运用抗菌肽和等速电泳对细菌的连续性微流体分析检测.doc

运用抗菌肽（AMPs）和等速电泳对细菌的连续性微流体分析检测 摘要：我们提出了一种对于水中细菌的连续定量检测的新微流控分析技术。我们利用等速电泳（ITP）聚焦技术，在微流体通道中打造了一个携带荧光标记的高浓度抗菌肽（AMPs）固定区。被测试的水样本从高浓度抗菌肽（AMPs）反应区连续流过，任何存在于样本中的细菌被同时标记，并从高浓度抗菌肽（AMPs）中分离。被标记了的细菌继续前进，进入下游的缓冲区后，在那里进行荧光信号的监测。这一过程实现了对样本中细菌浓度的直接定量测量。目前，我们通过大肠杆菌的定量检测实验证实了该技术的可行性。同时，超过1个小时的监测时间说明了该技术具有较好的稳定性。除此之外，我们为不同的分析条件，提供了一个用来预测装置性能的简单模型。该技术不仅可以扩展到其它类型的探针分析检测中，在提供连续分析的同时，还可对样本中特定的点的进行单独检测。 饮 用水质量问题仍然是造成全球性大规模死亡的主要原因之一。世界卫生组织（WHO）估计，每年340万起与水有关的死亡案例中，就有220万人因腹泻引起的疾病而死。这个问题并不仅限于发展中国家，在2009?2010年，仅在美国就有33个与饮用水有关的疫情报告，包括1040例疾病，85人住院，9人死亡。然而，大多数的感染是可被避免的——对水体进行检测。 水中的微生物检验的常规方法是将过滤后的样本在选择性培养基上的培养，再对培养出的菌落进行分析。这个检验过程需要一个专门的生物安全实验室和一批训练有素的人员分别在24和72小时下完成。两次实验的时间差在跟踪污染和防止疾病传播上是至关重要的。 快速检测技术基于基因型分析法与免疫测定法。特定目标核酸的酸序列基因型方法，典型的有rRNA或DNA，和利用扩增技术的方法：例如，比栽培方法（通常2?4小时）更精准的，更具体的，和更快的聚合酶链反应（PCR）。尽管，最近研究人员在PCR扩增方法上有很大的进展，但一个无菌的环境，一个专门的实验室和一批训练有素的人员通过多个样本的预处理来纯化核酸仍旧是必须的。免疫依靠细菌的特异性结合或结合菌株特异性抗体（AB）来瞄准目标细菌。传统的同时也是大多数建立的免疫分析技术是运用酶联免疫吸附测定（ELISA）和它的变体，利用该变体的表面固定化抗体，捕获样本中的目标抗原。ELISA的现代版则是运用免疫磁性分离技术（IMS），表面等离子体共振技术（SPR）以及固定碳纳米管，但在原理上并没有多大的改变。AB型方法的一个重要的优势是能够捕获存活的细菌，并可进一步研究和分析。但是，高成本的试剂（主要是抗体），多个较复杂的洗涤步骤，以及表面功能化的控制，这些在很大程度上限制了相关的实验采用此方法进行研究。因此，现在这种分析方法已经不再被广泛地使用了。  图1 （一）单直槽最简形式分析示意图。（a）荧光标记的抗菌肽（AMPs），最初在尾随电解质（TE）储层混合，通过阳离子等速电泳（ITP）聚集技术和真空驱动的逆流来固定（b）相似的，真空线也不断从前导电解质（LE）储层吸引存在潜在感染的水流。（c）任何在水中存在的细菌通过高浓度抗菌肽（AMPs）区时，在局部加速反应下被瞬间标记。被标记的细菌继续下行，而游离的抗菌肽（AMPs）仍然被固定在等速电泳（ITP）区，从而减少对下游信号检测的影响。（d）进一步下行，荧光信号由检测器显出。该信号对应于通过探测器的单个细菌以及样本中的细菌浓度。（二）荧光显微镜图像显示，在高浓度抗菌肽（AMPs）区大肠杆菌O：416的标记。可以清楚的从接口看到，最初未标记的细菌通过反应区时被瞬间标记。而游离的抗菌肽（AMPs）仍被固定在等速电泳（ITP）区。 近年来，人们在运用微流体平台检测病原体的技术上有了显著的进步。虽然连续监测是非常理想的水质监测方法，但由于大多数情况下分析技术的能力有限，只能分析单一或有限数量的样本。这主要是因为其在样本预处理步骤存在难以攻克的难题：如细菌裂解，标签，洗涤，或过滤，这些步骤很难在一个连续的方式中实现。 等速电泳（ITP）是一种电泳技术，基于其有效电泳迁移率，能够使离子分子分离或富集。该技术的特性在于：不连续的介质通过缓冲系统（LE）电解质和（TE）电解质，具有特定电泳迁移率的带电分析物，在对电泳施加一个电场后，会集中在一个狭窄的LE-TE界面。本技术已被证实能使被测物浓度在2分钟内产生高达一百万倍的增加。最近的一些关于等速电泳（ITP）技术检测细菌的研究，例如：贝科维奇等人运用分子信标探针和等速电泳（ITP）技术，利用加速反应从细菌裂解液中检测出了16个rRNA基因。彭和奥卡塞恩等人运用等速电泳（ITP）技术，在样本预处理步骤避免了细菌的裂解。然而，这些方法仍然需要对样本做预处理（片外滤波和荧光预标记），因此只能对有限体积的样本进行分析。同样地，虽