10单分子操作及其应用解析.pptVIP

单分子操作 及其应用 单分子操作技术 单分子操作与研究应用 存在的问题与解决途径 单分子操作技术 单分子操作技术是指应用一定的实验仪器和方法，在单分子水平上对生物大分子的行为（包括构象变化、相互作用、相互识别等）进行实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵﹑调控等，是纳米技术和分子生物物理学的自然延伸和必然趋势。它包括原子力显微镜（AFM）、玻璃微针、光镊和磁镊、单分子荧光光谱技术等。 单分子操作技术 特点 与经典的分子生物学技术相比，单分子操作技术避免了从大量实验结果中取平均的需要，因而可以提供更为详细的生物信息。 是在单分子上进行的高效、直接、简便的操作 单分子操作技术 原理 原子力显微镜技术——其目的是为了使非导体也可以采用扫描探针显微镜( SPM)进行观测，其通过探针与被测样品之间的微弱的相互作用力来获得物质表面的形貌。 光镊技术——利用激光动量转移产生的辐射压力，从而形成具有梯度力场的光学陷阱，处在陷阱中的微粒受到梯度力场的作用，就被“钳住”。可用于测量生物大分子间微弱的力以及生物大分子的很小位移。 玻璃微针——利用商业拉针仪器可以拉出比原子力显微镜微悬臂的弹性系数更小的微针尖，将针尖进行修饰连接上生物分子（一般是DNA）的一端，另一端连在一个可移动的精密样品台上，样品台拉伸DNA并使针尖偏转，偏转量可以用来计算力 单分子光谱技术——是将荧光基团标记在生物大分子上，标记在生物大分子上的荧光基团发生各种特性变化，通过光谱分析等就能够得到有关分子间相互作用、 酶活性、 反应动力学、 构象动力学、 分子运动自由度以及在化学和静电环境下活性改变的信息。 单分子操作技术的研究应用——核酸与蛋白质 DNA拉伸与扭曲 DNA凝聚 核酸解链与从新折叠 单分子酶学 DNA拉伸 核酸单分子操作研究起始于1992 年Smith 等对单个DNA 分子的弹性测量。 一段双链DNA 分子的一端连接到玻璃表面上,另一端连接到磁性小球上，DNA 分子连接到不同固体表面是通过生物素--链霉抗生物素蛋白、地高辛免疫的特异反应来实现的； 整个体系的组装在溶液中完成, 在外加磁力的作用下, DNA 被拉伸, 借助于显微镜,就能测量到小球的位移。 可以得到在不同盐浓度缓冲液中的单个 DNA 多聚体( 48502 个碱基对) 的力-延伸曲线,并且在这个实验中力最大只增加到10 皮牛顿。 DNA拉伸 当大于60pN外加作用力作用于DNA上时，一个意想不到的现象出现了：双链DNA分子发生了70％的过度延伸。这种现象的出现是由于DNA发生了结构上的转变，转到了一个称之为s．DNA的时相。 在Cluzel等的实验中利用一根光纤作为力传感器，DNA分子一端连接在光纤上，另外一端连接在小球上，小球通过吸力作用被固定在一个微吸液管上。移动微吸液管，DNA分子就被拉伸，光 纤因此发生偏移，通过一个位置敏感的光敏二极管检测传送的激光束信号来记录光纤偏移的位置。 DNA拉伸 在Smith等的实验中，两个小球分别连接到DNA分子的两端，一个小球由微吸液管控制，另外一个小球由光镊子控制。光镊子不仅能“钳住”小球，也能作为力传感器，因而能够测量作用力的大小。移动微吸液管，两小球之间的距离变大，DNA分子被拉伸，因此得到力．延伸曲线。 DNA扭曲 原理：双链DNA分子的弹性对分子的螺旋很敏感。利用一个能在连接点处阻止旋转的分子基团(如引人多个生物素和digoxygenin基团)，旋转DNA分子，DNA分子扭曲，因而能对DNA分子的弹性与扭曲张力之间的关系进行详细的研究。在这类实验中，一般使用在连接点处连接磁性小球，然后用旋转磁铁诱导旋转¨。 DNA凝聚 DNA凝聚对于亲代细胞准确分裂成两个子代细胞来说是必须的，因为压缩状态的DNA比处于展状态的DNA更容易分裂。 不同外界因素也能够诱导DNA凝聚，如多胺(精胺和亚精胺)、三价(或高价)金属离子、生物大分子荧光染料探针(如吖啶橙)、阳离子聚合物(如聚乙烯．乙二醇、PEG)¨引等。这几种因素能够单独或联合作用诱导DNA凝聚。DNA分子与这些因素作用并迅速降温，从而发生凝聚，从B型结构转变到A型结构，凝集成不同形状。 Case等人应用单分子操作技术对DNA凝聚进行了研究。他们研究了原核生物Escherichiaoli沉集素(condensin)蛋白(MukBEF)对DNA的凝聚作用。Strick等后来对真核生物Xenopus laev／s沉集素I(condensin I)进行单分子研究。 DNA凝聚 核酸解链与从新折叠 在核酸解链与重新折叠的实验中,依赖碱基顺序