_核酸的研究方法重点.pptVIP

一、核酸的分离、提纯和定量测定 2、RNA的分离纯化 二、核酸的超速离心 四、核酸的核苷酸序列测定 （一）DNA酶法测序 1 、加减法 Sanger于1975年设计的DNA快速测序法称为“加减法”，其原理为： 1）以DNA单链为模板，4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）和DNA聚合酶，使合成反应尽可能是随机的，合成产物中各种长度的片段都存在。 2）从反应体系中除去 4 种dNTP,并将反应物分成 8 组，4 组用于加法系统，4组用于减法系统，其中： ① 加法系统每组分别只加A、G、C、T一种dNTP，DNA聚合酶的3 ’－5’外切酶活性将除该核苷酸外所有3’末端核苷酸都水解掉，于是3’末端都变成了该核苷酸。 ② 减法系统中，每组加3种dNTP（分别减去A、G、C、T一种dNTP）， DNA聚合酶能够把片度继续合成下去，直到遇上所缺的核苷酸才停止。这就得到了都在所缺核苷酸前一个核苷酸结尾的片段。 3）然后将各组样品进行含变性剂（8mol尿素）的聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影的图谱上可以推测出DNA的核苷酸序列。 三） DNA最新测序技术 1、质谱法(mass spectrometry) 新型的电离技术如电喷雾离子化和基质辅助激光吸收技术使利用质谱法分析大片段DNA 成为可能。 ◆美日瑞三国科学家分享2002年诺贝尔化学奖 瑞典皇家科学院把２００２年诺贝尔化学奖授予美国科学家约翰·芬恩、日本科学家田中耕一和瑞士科学家库尔特·维特里希，以表彰他们发明了对生物大分子进行识别和结构分析的方法，其中芬恩和田中的贡献在于开发出了对生物大分子进行质谱分析的“软解吸附作用电离法”，维特里希的贡献是开发出了用来确定溶液中生物大分子三维结构的核磁共振技术。他们三人的这些研究成果对于研究包括蛋白质在内的大分子具有“革命性的”意义。?? 质谱分析是全世界各个化学实验室都在使用的一种非常重要的分析手段。以前，它只是用于小分子的分析研究。现在，由于芬恩和田中的发明，质谱分析也可以用于生物大分子的分析研究。利用芬恩１９８８年所公布的研究成果，研究人员可以获得电荷蛋白质液滴，并最终获得自由盘旋的蛋白质离子，通过使它们运动可以确定其质量，测出飞过指定距离所用的时间。同时，田中还发明了另一种可以造成蛋白质自由盘旋的技术——软激光解吸附作用技术。研究人员可以用这种技术把取样击成许多小块，迫使分子释放出来。 2、DNA芯片测序 3、单分子测序法(single-molecule seguencing) 单分子测序法是美国Los Alames国家实验室(LANL )发展的一种通过检测标记在单个分子上的荧光进行DNA快速测序的方法。模板DNA分子首先通过酶法修饰或合成，使不同的荧光素标记不同的碱基，然后，用两个激光束(或称激光镊子lasertweezer)夹住标记的DNA分子，将其置于液流系统，从被固定的核苷酸上游端开始用外切酶逐一切下被标记的核苷酸， 通过单分子荧光探测器检测液流中切下的标记核苷酸，再根据检测到的信号顺序确定DNA顺序。 4. 光点测序 脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3’-末端时会释放1个焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,如加入的核苷酸结合则反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;如核苷酸未结合则反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,按此规律来测定DNA序列. 5、原子探针显微镜测序法(atomic probe microscopy) 扫描隧道显微镜（STM）和原子力显微镜（AFM）的发展使直接检测DNA分子结构成为可能。 其中STM是用一个直接大约相当于一个原子大小的导电探针扫描DNA分子表面，通过检测探针和DNA分子表面之间形成的隧道电流来确定DNA分子的三维形状。STM还可分辩单链DNA分子上的单个核苷酸。通过STM可观察双链DNA分子的双螺旋结构以及单个碱基对。 AFM通过检测扫描探针和分子表面间的作用力来确定分子表面形状。 虽然原子探针显微镜为直接描述DNA组成提供了美好前景，但就目前来说，如何定位DNA分子以便于检测是一个难题。 ●An overview of current and emerging technologies for genomic sequencing. ——Neil Hall . J. Exp. Biol., May 2007; 210: 1518 - 1525 五、DNA聚合酶链反应（PCR） * * 1、DNA的分离提纯 研究发现，真核生物DNA与蛋白质的复合物 (DNP）溶于水和浓盐溶液，但不溶于0.14mol/L的盐溶液，用苯酚或氯仿使蛋白质变性，DNA溶于上清