5基因工程第三节1要点.pptVIP

基因操作的基本步骤 本章目标和要求 一、概念 基因文库（ DNA 文库） 基因组文库 cDNA文库 PCR克隆 转化 转染 二、简述PCR的基本步骤 将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。 二、目的基因的制备方法 （一）物理分离法 （二）自基因文库中分离基因 （三）化学合成法 （四）多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR） （一）物理分离法 从供体细胞的DNA中分离,如鸟枪法 （二）自基因文库中分离基因 通过克隆技术将大分子DNA 编码的全部或绝大多数基因或基因组进行扩增后的DNA片段混合物，称为基因文库或DNA 文库包括基因组文库和互补DNA文库两种 　 　 1、 基因组DNA文库 存在于转化细菌内， 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合。 简称G－文库。 　 　 2、 cDNA文库 用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后， 建立的基因文库。简称 c－文库。 　　 青科大在DNA合成方法上取得重大突破 】?近日，青岛科技大学化学与分子工程学院马翠萍课题组一重要研究成果在线发表于化学领域国际顶级权威期刊《Journal of the American Chemical Society》上。此项研究发现几种DNA聚合酶具有内在的反转录酶活性，突破了DNA聚合酶只能以DNA为模板合成DNA的传统认知，对RNA的快速检测具有重要意义。 核糖核酸（RNA）不仅是遗传信息的载体，还是活细胞中生命功能的执行者，是一类重要的检测靶标，在分子生物学、医学诊断和疾病治疗中受到广泛的关注。一般地，检测RNA的方法都需要首先被反转录酶进行反转录形成互补DNA（cDNA），然后在DNA聚合酶的作用下进行扩增检测。马翠萍课题组的实验研究发现，几种DNA聚合酶（如DNA 聚合酶大片段），具有内在的反转录酶活性，即以RNA为模板反转录为cDNA的能力，并且这种cDNA能直接作为模板进行后续的扩增实验。此项研究的发现，突破了DNA聚合酶只能以DNA为模板合成DNA的传统观念，为实现RNA的单酶和一步法检测提供了酶学基础。这种一步法的检测可以大大缩短反应时间，降低实验费用，对核酸的即时检测，如血液核酸筛查、检验检疫（如艾滋病病毒、埃博拉病毒）等领域具有重要意义。 《美国化学会志》是国际化学类杂志的权威刊物，是化学学科最具影响力和历史最悠久的刊物之一，对所录用研究成果的原创性和重要性等都有很高的要求。此项研究的发表，标志着肿瘤标志物传感分析教育部重点实验室在核酸检测领域的研究迈上了一个新的台阶。 该项研究得到了国家自然科学基金项目的支持。 原文检索： Shi C, Shen X, Niu S, Ma C. Innate reverse transcriptase activity of DNA polymerase for isothermal RNA direct detection. J. Am. Chem. Soc., 16 October 2015; DOI:10.1021/jacs.5b08144 论文链接：/doi/abs/10.1021/jacs.5b08144   JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY 影响因子12.113,期刊... PCR 的三个步骤为一次循环，约需5－10 分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过 20 次循环，即可扩增 106 倍，总共只需几个小时。 核酸（DNA）的结构是一条双螺旋的长链； 基因则是链上的若干片段；核苷酸是组成片段的基本单位。 核苷酸是组成核酸的基本结构单位，核苷酸是核酸生物合成的前体。基因是核酸分子（DNA）的一个片段，由四种特定核苷酸按一定顺序串联而成 基因的功能由核苷酸顺序和表达调控所决定，二者若发生异常的改变，人体就会产生疾病 寡核苷酸是通过高科技生物酶解技术发现的。由核苷酸片段通过磷酸二酯键连接起来的，具有各类核苷酸功能的物质，是单碱基的核苷酸。 常规PCR操作过程 通常反应体积 50~100ul; PH8.4,10mmol/Ltris-HCL缓冲液， (含50mmol/LKCL,1.5mmol/LMgcl2)，100ug/ml明胶，引物各为0.25 mmol/L,dNTP各为200umol/L,2.5uTaqDNA聚合酶，0.1ug基因组DNA模板，液面加几滴液体石蜡，反应过程，通常于94oC变性30S,55oC退火30S,72oC延伸1min,循环30次。 PCR技术特点及用途 灵敏、简便、快速及特异性强。且对样品纯度无要求，其复制对象可为基因组DNA 、总RNA及细胞、发根、精子、活体组