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第二章 蛋白质的制备 ---细胞破碎与萃取 第一节 蛋白质制备总则 来源、 胞内（胞外）、 可溶性、 分子大小、 等电点、 稳定性（对温度、pH、蛋白酶、金属离子的耐受性）等 工业化应用：经济性（高收率，纯度次要） 一般研究：80%-90%纯度 结构研究：95%以上纯度 医疗：全面分析 三、确立有效成分的测定方法 吸附法 超滤法 沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀） 透析 三、确立有效成分的测定方法 色谱法（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等） 电泳法 （聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等） 3、根据蛋白质性质确立分离方法 溶解度不同：等电点，有机溶剂，盐析 电荷不同：电泳，离子交换 分子形状大小不同：离心，透析，凝胶过滤 四、蛋白质的制备流程： 首先： 材料的选择和预处理 细胞的破碎和细胞组分分离 有效成分的萃取 第二节 材料的选择、预处理与保存 微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。 （3）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原 料，如发酵液、提取液等。 第三节 细胞破碎 1、材料细胞的特性 动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法 植物细胞有细胞壁难破碎，须用中等或强度大的方法 微生物细胞较复杂，一般用较强的方法 2、目的物的特性 ⑶. 处理量 有些处理量大，如组织捣碎机等。 有些处理量少，如超声波破碎等。 ㈠ 机械法 1.组织捣碎机： 适用：动植物组织 ㈡ 物理法 ㈢．化学法 2．?表面活性剂法 破坏细胞膜，释放目的物（需与其它方法结合应用）。 （四）酶解法 2．?外加酶法 将细胞壁分解，使内含物释放出来。 细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA） 酵母：采用β-葡聚糖酶 霉菌：添加几丁质酶 植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。 例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累 包涵体（inclusion bodies），或包含体，是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包涵体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。 包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包涵体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机理研究提出了新的课题。 重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素－６、人γ－干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒－包涵体（inclusion bodies IBs)。 3、包含体特点: 几种常见的工艺路线（一） 几种常见的工艺路线（二） 几种常见的工艺路线（三） 基因工程包含体的纯化方法 一、概述 1、基本概念及分类 概念：萃取是利用溶质在互不混溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。 根据萃取原理分类的 基本概念 化学萃取 利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过程。 2、萃取技术的操作特点 ① 萃取过程具有选择性 ② 能与其他纯化步骤相配合 ③适用于各种不同的规模 ④传质速度快，生产周期短，便于连续操作 3、萃取需要考虑下列问题 d．乳化 乳化剂类型 （亲憎平衡值） 乳化与去乳化 三 反胶束萃取 （反胶团萃取） 1、基本术语 反胶束(reverse micelles): 若向有机溶剂中加入一定浓度S和水，在有机溶剂中所会形成内部含少量水的胶束。 微水相或“水池”(water pool)：反胶束内溶解的水。 2 反胶束的溶解作用 微水池溶解和分离作用： 反胶团的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子, 为生物分子提供易于生存的亲水微环境. 因此,反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。 2 反胶束的