第五章基因的分离与鉴定2祥解.pptVIP

应用表达文库 分离克隆的目的基因 当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。 表达文库分离克隆的目的基因 1.表达的蛋白质以融合蛋白质的形式存在，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，不易被原核细胞中的有关蛋白酶消化降解，因而显得比较稳定，可以得到较高的表达水平。 2. cDNA片断必须置于启动子序列下游，在其控制之下；按正确的取向和读码结构插入，确保产生正确的蛋白质。 特点： 1. 利用抗体筛选表达文库； 2. 测定蛋白质的功能； 3. 用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库。 筛选的方法： 将菌落或噬菌斑原位复制到膜上 处理之后蛋白质暴露，与第一抗体温育 漂洗未结合的抗体，加入经标记的第二抗体 能与第一抗体结合 抗体筛选表达文库 生物化学研究表明，存在Ca＋＋离子的条件下，钙调蛋白能与许多种酶结合形成稳定的复合物。 将放射性同位素标记得钙调蛋白用作探针筛选cDNA表达文库，鉴定能够表达出与它特异性结合的目标蛋白质的阳性克隆。 2.测定蛋白质的功能 鉴定能够表达出与特定DNA片断（真核启动子中与转录因子结合的DNA元件）结合的目标蛋白质的克隆。 3.用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库 酵母双杂交体系 （two-hybrid system） 有效的分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。 应用于真核基因地表达调控，细胞粘合因子间的相互作用、信号转导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等研究 酵母双杂交体系又叫相互作用陷阱 (interaction trap) 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域组成（example）； 应用重组DNA技术，也可以将来自同一个转录因子的、或者两种不同转录因子的、分开的两种结构域，在体内重新组装成具有功能的转录因子，从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的报告基因的表达。 基本原理： 酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4，在N端1～147位氨基酸区段有一个结合域（ DNA-binding domain, DNA-BD ）； 在C端768～881位氨基酸区段有一个转录激活域（transcription activation domain,AD）DNA -BD 能识别激活序列并与之结合；AD通过同转录机制中的其它成份之间的结合作用启动下游基因进行转录。 用DNA重组技术将它们分开，即使在同一个寄主中表达，也不会直接发生相互作用不能激活相关的效应基因进行转录。 Example: 寄主菌株：剔除掉GAL4基因的酿酒酵母 1. SFY526和HF7c带有报告基因lacZ、 HIS3和LEU2 2.还有两种可以在大肠杆菌和酵母中自主复制的穿梭载体 a. pGBT9(DNA-BD)：靶基因是按正确的取向和读码结构被克隆在载体的多克隆位点区内，于是靶蛋白和GAL4-BD之间产生融合作用，形成杂种蛋白质? b.第二种质粒载体pGAD424(AD质粒载体)用来构建cDNA表达文库专用载体，克隆cDNA片断是按正确的取向和读码结构插入在 载体的多克隆位点区内，因此由cDNA 编码的蛋白质便会同GSL4-AD之间产生融合作用，形成杂种蛋白质?。 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； 构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体; 把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。 从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。e. 将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。 酵母双杂交体系的主要实验过程： go 1. 遗传检测法 2. 物理检测法 3. 菌落或噬菌斑杂交筛选法 4. 免疫化学检测法 5. 蛋白质筛选法 6. 转译筛选法 重组子分子的选择与鉴定 重组子、目的重组子与非目的重组子由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目