浙江大学生物化学实验甲PCR基因扩增与性别鉴定课件.pptVIP

PCR基因扩增与性别鉴定原理 1、PCR技术的原理 PCR技术是多聚酶链式反应技术的简称，由K.B.Mullis于1983年发明，为一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。 PCR技术操作简单，可在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝，因此PCR技术虽然问世时间仅数年，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域。在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面均得到了广泛的应用。 PCR基因扩增与性别鉴定原理 PCR技术与细胞内发生的DNA复制过程十分类似，为在模板DNA、引物（16bp以上，最好为20~24bp和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。按照反应的特点可将其分为三步： ⑴、变性 通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解开形成单链。 ⑵、退火 使碱基互补的链形成双螺旋结构。 PCR基因扩增与性别鉴定原理 由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少； ⑶、延伸 在DNA聚合酶和4种脱氧核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，由DNA聚合酶5’→ 3’的聚合酶活性催化以引物为起点的DNA链延伸反应。 以上3步为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段将得到大量的复制，数量可达到2×106~7拷贝。 0 0 PCR基因扩增与性别鉴定原理 如图所示，经过高温变性，低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。 每循环一次，目的DNA的拷贝数加倍，随着循环次数的增加，目的DNA以2n的形式积累。 因此，PCR技术可应用于只含有痕量DNA的样品，包括一根头发血迹等，这对法医学具有重要意义。 2、性别鉴定的原理 PCR基因扩增与性别鉴定原理 人的性别由性染色体决定，男性的性染色体为XY，女性为XX。 在男性的Y染色体上具有一段特异的DNA序列，大小为154bp，称DYZ1序列，该序列不存在于X染色体上。 因此当用男性的性染色体进行该片断的特异性扩增时，应可扩增出大量的DYZ1序列产物，而用女性的性染色体进行同样条件的扩增，则无扩增产物出现，这样通过电泳检测扩增产物的有无，即可将性别鉴定出。 PCR基因扩增与性别鉴定原理 3、核酸电泳的原理 核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动，根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及形状的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。 电泳中所使用的支持介质为琼脂糖凝胶，不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离200bp~50kb的DNA片断，通过在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹光染料溴乙锭（EB），在紫外光下即可检测出10ng的DNA条带。 * * （DNA分子数225~30） 循环25~30次 目的DNA数目达到106~7 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 94℃变性，双链DNA分子解链成为两条单链 5’ 3’ 3’ 5’ 引物1 引物2 55℃退火，引物与模板DNA结合 72℃延伸，以引物为起点延伸DNA链 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ （DNA分子数21） 94℃变性（第2次循环） 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 引物1 引物2 55℃退火 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 72℃延伸 （DNA分子数22）