蛋白质的通性纯化和表征.解读.pptVIP

* * 记 录 仪 低温层析柜 （1）基本原理 利用被分离物质的电荷与层析载体电荷的相互作用达到分离纯化。 基质：纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖、 层析载体由基质和带电基团组成 层析载体的种类： ①阳离子交换剂（带负电） 如：磺丙基（强酸型）SP-Sephadex -O-(CH2)3-SO3H ②阴离子交换剂（带正电） 如：二乙基氨基乙基（中强碱型） 纤维素离子交换剂 交联葡聚糖离子交换剂 盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容量。 因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH来完成。 蛋白质与离子交换剂间的主要作用：静电引力 （2）基本操作 1、样品准备 2、离子交换剂和层析柱的制备 选择合适的离子交换剂，进行预处理，柱床体积为样品体积的2-5倍。 3、上样。 4、目的蛋白的洗脱 洗脱方式有逐步提高洗脱液的盐浓度（离子强度）和逐步提高洗脱液的pH。 5、洗脱液的鉴定和回收 蛋白质成分常用280nm紫外吸收法监测 （四） 亲和层析 亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，建立起来的一种有效的纯化方法。 配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体等。 亲和层析的原理： 亲和层析的原理 （五）高效液相层析(HPLC) HPLC纯化蛋白质的报告大多局限于实验室规模(数毫克到数十毫克) Waters公司的HPLC已备有大规模制备的层析柱。 将亲和层析的高分辨力和HPLC的快速结合 　 高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致。 ?? 高效液相层析仪 典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用高压泵输入。 一般用微量注射器直接进样，也可采用六通阀门进样。HPLC中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测(UV)，灵敏度可达ng水平。此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。 高效液相层析仪的结构简图 五、蛋白质相对分子质量的测定 （一） 凝胶过滤法测定相对分子质量 凝胶过滤所用介质为凝胶珠或称为凝胶颗粒，其内部为多孔网状结构 凝胶颗粒中具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入凝胶颗粒内部，而大于胶粒微孔的分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液先流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大 测定蛋白质分子量一般用交联葡聚糖作为凝胶，商品名：Sephadex 测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量 （二） SDS—PAGE（十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳） 用SDS和巯基乙醇（能打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质 复合物 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的相对迁移率作图。同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小。 测出待测样品的相对迁移率 从标准曲线上查出样品的相对分子质量 ★ 优点：快速，样品用量少。 缺点：误差大，约为±10％（误差主要来源于迁移距离的测量误差） ★ 此方法只能测得单体蛋白质、寡聚蛋白质的亚基的相对分子质量 （三）沉降速度法测定相对分子量 离心分离 原理：当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴。在相同转速条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降。经过一定时间的离心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有效分离。 离心转速：低速离心机2000～6000r/min， 高速离心机18000～25000r/min，超速离心 机 40000~80000r/min 沉降速度： 在离心时，沉降分子在单位时间t（以秒计）内下沉的距离x（以cm计）。以v表示。 v= dx/dt 沉降系数（sedimentation coefficient) ： 单位离心场沉降分子的沉降速度。 dx/dt s= v /ω2x = ─────