第十四章基因工程与蛋白质工程.解读.pptVIP

受体细胞和重组基因的导入（转化或转染） 将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤： 1．获得目的基因和质粒载体； 2．形成重组质粒； 3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞； 4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝； 5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。 pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出?半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-gal，X-gal（ ?半乳糖苷酶的底物）便会被?半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆 利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒 筛选克隆 pUC18载体还携带了抗生素（antibiotic）基因，可筛选重组质粒。 一般克隆基因的检查和鉴定方法 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻力 ——不同迁移率 分子量标准参照物 酶切和电泳方法 Restriction mapping 酶切 克隆基因的检查和鉴定方法 32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法 DNA杂交直接鉴定 植物遗传转化常用的方法 载体法转化——农杆菌介导法（Ti质粒） 基因的直接转移 （1）高压电脉冲电激穿孔 （2）基因枪法 （3）微注射法 构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株（直接转化重组质粒） 纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析 五、转化子的分析——Southern杂交 鉴定克隆---Southern分子杂交 Southern杂交分析示例 A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中 1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。 第二节 蛋白质工程 2.1 蛋白质工程的理论基础 蛋白质工程的概念 蛋白质的结构 蛋白质结构预测 一 蛋白质工程的概念 基于对蛋白质结构和功能的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论或实践活动。 （1）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系； （2）通过定点突变、定向进化等技术，合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质。 二 蛋白质的结构 一级结构：多肽链的氨基酸残基的排列顺序 二级结构：多肽链借助于氢键或离子键沿一维方向排列成具有周期性结构的图象。 三级结构：指整个蛋白质多肽链在二级结构的基础上，侧链基团通过次级键或疏水键的相互作用进一步盘曲折叠，形成具有一定规则的空间结构 。 四级结构：由两条以上的多肽链组成的蛋白质，多肽链之间没有共价键连接而是借疏水作用等次级键缔合在一起形成的高级空间结构 。 氨基酸的聚合形成肽链 肽链的空间结构单元: 二硫键的折叠 肽链的空间结构单元 :氢键的折叠 肽链的空间结构单元 :离子键的折叠 肽链的空间结构单元 每四个氨基酸残基间的 氢键构成多肽链 a 螺旋 肽链的空间结构单元 由不同多肽链上氨基酸残基间的氢键构成多肽链 b 折叠 肽链的完整空间构象 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质一级结构是空间结构的基础，而空间结构决定了蛋白质的功能。 结构域：蛋白质多肽链上一段在三维结构上可以明显区分和相对独立并具有一定生物学功能的基本单位。 模体（基序）：组成结构域的基本二级结构单位 蛋白质的加工修饰 :磷酸化修饰 蛋白质的加工修饰:羧基化修饰 几种参与凝血的蛋白因子（如 VIII 和IV因子）需要在其谷酰胺侧链上的g-羧基化修饰后，才能拥有蛋白酶的活性，这一修饰过程依赖与维生素K 的存在。 蛋白质的加工修饰:甲基化修饰 肌肉中的一些蛋白质以及细胞色素C中的Lys会受到单甲基和二甲基化修饰；钙调蛋白会受到三甲基化修饰；所有C末端以Glu结尾的蛋白质，其Glu会受到甲基化修饰。 蛋白质的加工修饰: N-糖基化 O-糖基化 糖基化修饰 生物化学 主编 张洪渊 万海清 生物化学（第三版） 主编 张洪渊 万海清 参编 刘文彬 李永红 姚舜 生物化学 第十四章 基因工程与蛋白质工程 学习目的与要求 了解目的基因取得的方法；了解基因载体的作用；了解DNA重组体构建的步骤。 理解蛋白质工程的概念、研