胰岛素的制备.解读.pptVIP

1．5％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，然后用EcoR Ⅰ和BamHⅠ 双酶切，回收后与pJGl03(含B—C—A人胰岛素原基因)载体大片段连接(经EcoR Ⅰ和BamHⅠ双酶切后回收)，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α． 1．2．2 质粒pJGll2的筛选和鉴定 酶切筛选：将转化出的单菌落采用常规小量质粒制备方法制备质粒DNA，取1μg DNA，用EcoR I和BamH I双酶切后进行1．5％琼脂糖凝胶电泳，凡有约380bp片段出现的重组克隆作序列分析鉴定． 温度诱导表达筛选：挑取转化的单菌落，37 ℃培养过夜，次日扩大10倍37℃培养3 h，42℃诱导4—6 h。离心得菌体，适量无菌水悬浮后，取适量菌体悬浮液进行15％SDS—PAGE，以pBV220和pJGl03转化菌液作为对照． DNA序列测定：采用izard?plus Minipreps DNA purification System提取测序模板，采用Sanger双脱氧终止法，测序反应按Pharmacia公司T7SequencingTMKit说明书进行．6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析． 1．2．3 Met—Lys—双C肽人胰岛素原基因的摇瓶表达 挑取单菌落于3 ml LB Amp+培养液中，37℃培养12 h，扩大100倍30℃培养过夜，次日上午以1：10稀释，30℃培养4 h，42℃诱导6 h，6000r／min离心收获菌体． 1．2．4 Met—Lys—双C肽人胰岛素原的分离纯化 20g湿菌体经超声破碎细胞，裂解包含体，还原，重组，超滤浓缩至6～7 ml的重组液．经SephadexG—75(1．7cm×l00cm)层析分离，收集目的蛋白．取少量进行“％SDS—PAGE分析，其余的调pH2．5～3．0，加入NaCl使终浓度达12％(W／V)，离心，收集沉淀，冰冻保存． 1．2．5 Met—Lys—双C肽人胰岛素原转化为人胰岛素 取适量上述胰岛素原类似物盐析沉淀溶于0.05mol／L Tris—HCL pH7．5缓冲液，经紫外吸收法准确测定Met—Lys—双C肽HPI的浓度后，加入适量胰蛋白酶和羧肽酶B，使质量比例分别为50：1和300：1，37℃反应0．5 h，立即冷却，终止反应，酶解液用HCl调pH2．5～3．0，并加入异丙醇使其浓度达40％(V／V)经ResourceTMQ(1 m1)阴离子交换柱分离，采用NaCl盐浓度梯度为0～0．15 mol/l的上述缓冲液进行洗脱，以猪胰岛素作为对照，收集胰岛素峰，用0．5mol/l乙酸透析除盐，冻干备用． 结 果 2．l 重组质粒的构建 利用5′端起始密码子ATG和胰岛素B1 TTT之间加入Lys密码子AAG的突变引物相3′端通用引物，以含双C肽胰岛素原基因的质粒pJG111作模板，进行PCR扩增，获得约380bp的产物，由于胰岛素原基因的5′端和3′端分别引入了EcoR I和BamH I酶切位点，因此PCR产物和载体质粒pJGl03(含B—C—A人胰岛素原基因)可分别用这两种酶酶切后产生粘性末端，经回收的PCR产物酶切小片段与载体大片段连接，转化E．coliDH5α后获得重组质粒pJG112，采用3种方法进行筛选和鉴定。 首先提取pJG112质粒DNA，经EcoR I和BamH I双酶切筛选，产物进行1．5％琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明双酶切的小片段大小与pJG111双酶切小片段相近，约370 bp，比pJGl03双酶切的小片段(约280 bp)大，初步说明已获得突变胰岛素原类似物基因，并重组到pJGl03质粒内。 鉴于所用载体为一个表达型载体，所以可进行表达筛选．将初步筛选出的阳性克隆小量进行表达，产物进行SDS—PAGE分析，结果表明在电泳条带的前沿有明显表达带，分子大小比pJGl03质粒表达产物Met人胰岛素原大，由于pJG111表达产物为Met—双C肽人胰岛素原，与pJG112表达产物Met—Lys双C肽人胰岛素原仅有一个氨基酸差别，故二者条带位置相近，而对照质粒pBV220(空载体)表达产物中的上述二个相应位置处均无明显条带。 最后进行DNA序列测定分析：在Met—Lys—双C肽人胰岛素原基因序列中有一个Lys密码子AAG插在于起始密码子ATG和B1 Phe密码子TTT之间，测序电泳结果表明突变已正确发生，从而获得重组质粒pJG112。 （二）其他方法 1、基因工程方法构建小C肽人胰岛素原类似物（B—2R—A）制备胰岛素。 2、将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白A的基因上，构建成大肠杆菌中基因融合