基因诊断与基因治疗2.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * AAV载体的缺陷 AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段； 感染效率比反转录病毒载体低, 在40%-80%的成人中存在过感染; 可能会引起免疫排斥。 常用基因治疗载体 ? 整合 致病性 感染细胞 克隆容量 反转录病毒 载体 随机整合，效率高 可能致病 分裂细胞 7kb 腺病毒载体 不整合，可能丢失 不致病 分裂细胞、非分裂细胞 ? 腺相关病毒载体 定点整合(19号染色体特定区域) 不致病 分裂细胞、非分裂细胞 5kb 7.5kb 2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转移至细胞内，并进行表达。 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 脂质体介导的基因转移示意图 （2）受体介导转移技术 将DNA通过多聚阳离子与细胞配体偶联，多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。 受体介导转移技术示意图 （3）基因直接注射技术 将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%； 将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ 。 基因直接注射法的优点 制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。 三、基因干预 （gene interference） （一）反义RNA（antisense RNA） 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 （2）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。 反义RNA的关键技术问题 反义RNA进入靶细胞前的降解问题 专一性转移问题 2.受体介导反义RNA技转移术 ①受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高； ②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。 借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义RNA转移。 3. 反义RNA的优点 （l）安全性高 （2）反义RNA设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （4）能直接作用于一些RNA病毒 （二）干扰RNA RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制该基因的表达。 RNA干扰的机制 RNA干扰过程主要有2个步骤： （1）小干扰性RNA（siRNA） （2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)。 该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断 长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA） RNA干扰机制示意图 研究基因功能的新工具? 由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。 ? RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段。 1. 体外