分子杂交技术hu解析：.ppt

南昌大学生命科学学院 胡宝庆 E mail: baoqinghu @ Tel 定义： 用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。 待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。 特点： 灵敏度高（1pg互补序列） 速度快（24h） 简单易行 应用： 基因克隆的筛选 酶切图谱制作 基因组中特定基因序列的定量和定性检测 基因突变分析 疾病的诊断、微生物病原体检测 第一节 核酸杂交基本原理 第二节 核酸探针标记的方法 第三节 几种常见的杂交 第四节 其他类型杂交介绍 第五节 原位杂交 分子杂交(简称杂交，hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。 原理： 应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(或RNA)片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。 因此，变性技术也是核酸杂交的一个环节。 1、变性： 在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。 引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 加热变性是最常用的方法，一般加热 80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。 变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。 A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。 Tm=（G+C）%×0.41+69.3 Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。 2、复性 在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。 在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。 复性过程： 第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。 影响复性的因素 单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快。 核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对的难度也大，复性也慢。 核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。 温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比Tm低25℃。 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。 分子杂交的基本过程 1、样品制备 从待检样品提取DNA或RNA。DNA先用酶消化成大小合适的片段，然后用凝胶电泳进行分离，再将含DNA片段的凝胶做变性处理，转膜固定。RNA样品可直接在变性条件下电泳分离，然后转膜固定。 2、探针制备 作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30-50bp，探针上需标记上可直接检测的元素或分子。 3、杂交 将处理后结合在硝酸纤维素膜上的待检样品与溶液中的标记探针进行杂交，杂交前要进行预杂交，即用非特异性核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。 4、检测 依据标记探针的方法而异，用放射自显影或免疫组化的方法来进行检测。 影响核酸分子杂交的因素： 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。 离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形成。 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进