碱性脂肪酶的纯化和酶学性质的鉴定报吿.docVIP

目 录 1 前 言 1 1.1 碱性脂肪酶概述 1 1.2 脂肪酶的来源 1 1.2.1 植物来源的脂肪酶 1 1.2.2 动物来源的脂肪酶 1 1.2.3 微生物来源的脂肪酶 2 1.3 脂肪酶的性质 2 1.3.1 脂肪酶的编码基因 2 1.3.2 结构 3 1.3.3 作用机理 4 1.3.4 反应类型和底物特异性 4 1.4 脂肪酶的研究现状 5 1.4.1 脂肪酶的选育 5 1.4.2 脂肪酶的发酵生产 6 1.4.3 脂肪酶的活力测定 7 1.4.4脂肪酶的分离纯化 7 1.4.5 脂肪酶的固定化研究 8 1.4.6 不动杆菌脂肪酶研究进展 9 1.5 脂肪酶的应用 10 1.5.1 洗涤剂工业 10 1.5.2 环境治理 10 1.5.3 食品工业 11 1.5.4 造纸工业 11 1.5.5 医药工业 11 1.5.6 生物柴油 11 1.5.7制革工业 12 1.5.8 化妆品 12 1.5.9有机相中酶催化合成 12 1.6 复合诱变技术及其在菌种选育中的应用 12 1.7 本课题的研究目的和意义 13 1.8 研究内容 14 2 材料与方法 15 2.1 实验材料 15 2.1.1 菌种 15 2.1.2 质粒 15 2.1.3 主要试剂 15 2.1.4 仪器设备 16 2.1.5 培养基 18 2.1.6 溶液 18 2.2 实验方法 20 2.2.1 分析方法 20 2.2.2 产稳定性碱性脂肪酶菌株筛选方法 24 2.2.3 菌种鉴定及脂肪酶基因分析 24 2.2.4 脂肪酶的分离纯化 27 2.2.5 复合诱变 28 2.2.6 菌种保存方法 30 3 结果与讨论 31 3.1 产稳定性碱性脂肪酶的筛选 31 3.2 菌种鉴定及脂肪酶基因的分析 31 3.2.1 菌种鉴定 31 3.2.2 脂肪酶基因分析 32 3.3 稳定性碱性脂肪酶的性质 35 3.3.1酶的最适作用温度 35 3.3.2酶的热稳定性 35 3.3.3 酶的最适作用pH 36 3.3.4酶的pH稳定性 37 3.3.5 脂肪酶的底物特异性 37 3.3.6金属离子对酶活性的影响 38 3.3.7酶对洗涤剂添加成分的稳定性 39 3.4 稳定性碱性脂肪酶的分离纯化 40 3.4.1 盐析 40 3.4.2 脱盐浓缩 40 3.4.3 Cellulose DE-52 离子交换层析 40 3.4.4 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 41 3.4.5 稳定性碱性脂肪酶的纯度鉴定及分子量测定 42 3.4.6 稳定性碱性脂肪酶的纯化回收情况 42 3.5 产酶培养基的优化 43 3.4.1 碳源对产酶的影响 43 3.5.2 诱导物质对产酶的影响 43 3.5.3 氮源对产酶的影响 45 3.5.4 磷源对产酶的影响 46 3.5.5初始pH对产酶的影响 47 3.5.6 7L罐放大试验 47 3.6复合诱变选育脂肪酶高产菌 49 3.6.1 菌体生长曲线的测定 49 3.6.2 紫外诱变 50 3.6.3 硫酸二乙酯（DES）诱变 50 4 结 论 53 5 展 望 54 6 参考文献 55 7 发表论文情况 63 8 致 谢 64 1 前 言 1.1 碱性脂肪酶概述脂肪酶(1ipase)全称为甘油三酰酯水解酶，主要水解和合成由甘油和12个碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，它是一种特殊的酯键水解酶只能在异相系统或不溶性系统的油-水界面水解酯。按照国际生化联合会的命名分类原则，脂肪酶编号为EC 3.1.1.3，系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶，习惯名称为脂肪酶[1]。脂肪酶水解脂肪具有高效、反应条件温和、无毒等优点。它不需要辅酶即可催化油-水界面的甘油三酯水解生成甘油及长链脂肪酸脂肪酶水解脂肪后的产物为甘油二酯、甘油一酯、脂肪酸和甘油。 脂肪酶在自然界中存在，但是只有微生物脂肪酶具有商业价值。目前，脂肪酶在医药、洗涤剂添加酶、生物素的合成、有机质合成、油脂的水解、油脂的改造、食品工业中的风味增香、外消旋物质和其他化合物的合成[2]、皮革绢纺原料脱脂和洗涤剂、污水处理等许多工业领域中均有应用价值[3]。此外，近年来非水相酶学的研究又进一步拓宽了脂肪酶的应用领域，利用脂肪酶在有机相催化的各种反应，可以合成许多高附加值产品。碱性脂肪酶是在碱性条件下水解脂肪的酶据估计，洗涤剂用酶占据了脂肪酶总销量的32%。但是，作为洗涤剂添加剂的脂肪酶必须具有以下特性：较低的底物特异性，具有水解多种脂肪类底物的能力；能够适应洗涤剂的极端环境（pH10-11，温度30-60）具有表面活性剂和一些洗涤剂添加酶的稳定性（如LAS和蛋白酶）。因此，越来越多的科学研究和商业开发致力于该种脂肪酶产生菌的筛选与构建。1.2