原生质分离纯化解决方案.pptVIP

实验五 植物原生质体的分离纯化与活性鉴定 实验原理 植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质 体的影响。　　 实验原理 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 试剂： (1)酶解液：2.5%(W／V) 纤维素酶,2.5% (W／V)果胶酶,0.7mol／L甘露醇;10mmol/L CaCl2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 6.8～7.0。 (2)13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/L KH2PO4,101.0mg/L KNO3,1480.0mg/LCaCl2.2H2O,246.0mg/L MgSO4,0.16mg/L KI ,0.025mg/L CuSO4.5H2O,13%(W/V)甘露醇,pH 6.0。 (3)酶解液(烟草)：用01％2-N-吗啡啉乙磺酸钠配制2％(W／V)纤维素酶,1％ (W／V)果胶酶,005 mmol／L氯化钙,0.6 mol／L甘露醇,pH 6.0。 (4)洗涤液(烟草)：0.2 mol／L氯化钙, 加有01％2-N-吗啡啉乙磺酸钠,pH 6.0。 (5)0.1％2-N-吗啡啉乙磺酸钠或三羟甲基氨基甲烷溶液：内含20％蔗糖,pH6.0。 (6)0.02%二乙基荧光素(FDA):5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下贮存,使用时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用时,使最终浓度为0.01%。 (7)20%蔗糖溶液 (8)无菌蒸馏水。 分离 1 取材：选取生长良好的愈伤组织。 2 净化工作台取样：用镊子将愈伤组织从培养瓶中取出（进化工作台使用方法）。 3 酶解：铺于酶液中，充分接触酶液。25~30℃酶解8小时，期间可晃动培养皿1~2次。 4 每隔30min取1ml溶液1000rpm离心5min，弃上清液，加1mlCPW洗液清洗两次。 5 在血球计数板上计算原生质体的数量。 纯化 1）过滤：用双层漏斗将原生质体过滤到离心管中。 2）纯化-漂浮法：用比原生质体比重大的20%蔗糖盐溶液经过离心后原生质体漂浮在蔗糖溶液的表面。（还有沉降法） 活力检测 用13% CPW液洗涤1～2次,每次1000rpm离心5min,得到较为纯净的原 生质体。用13% CPW液悬浮至一定密度并制一张装片,观察。 取1滴原生质体提取液在载玻片上,加入相同体积的0.02%FDA稀释液,静置2min 后,于荧光显微镜下观察,发绿色荧光的为有活力的原生质体,没有产生荧光的原生质体无活力。 * * 实验目的： 2 了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。 1 学习植物原生质体的分离和纯化技术； 实验用品： 用具：尼龙过滤网（400目）、双层漏斗、吸管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片等。 药品：纤维素酶、果胶酶、8%甘露醇盐溶液、20%蔗糖盐溶液等。 实验材料： 山丹丹愈伤组织等。 过滤后的液体进行500rpm，3min离心，收集原生质体 弃上清，沉淀用 2 ml 8%甘露醇盐溶液轻轻悬浮 在一新离心管中加入6~8 ml的20%蔗糖盐溶液，将原生质体悬浮液轻轻环加在蔗糖盐溶液上面 1000rpm，3min离心，漂浮原生质体 原生质体在蔗糖溶液上面形成绿环，吸出原生质体置于另一离心管中 再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次 5镜检：将原生质体悬浮液滴在载玻片上，轻轻盖上盖玻片，先在低倍镜下找到原生质体，再换成高倍镜仔细观察。 实验报告： 1 画出在显微镜下看到的原生质体的图像； 2 在整个实验操作过程中需要注意哪些问题？ 结果与讨论： 1 预期结果：完整的原生质体形态上是圆球状的，颜色鲜艳，富含细胞质。 *