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原位杂交的地位 免疫学检测技术 免疫组织化学法 免疫印迹法（Western blot） 酶联免疫吸附检测（ELISA） 放射免疫检测 分子生物学技术 PCR 多重PCR 实时荧光定量PCR Southern blot Northern blot 斑点杂交 原位杂交 生物芯片 在一定的条件下，应用标记抗体（抗原）与组织切片或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应。如果组织或细胞中含有相应抗原（抗体），二者结合形成抗原抗体复合物，其中所带的标记物如酶或荧光素遇到底物或激发光时产生显色反应，在显微镜（包括普通光镜、荧光显微镜和电子显微镜）下，就可以原位确定组织中或细胞内抗原的分布位置和性质；经图像分析也可达到定量的目的。 具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的，但杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补。 杂交的双方是待测核酸序列及探针。将核酸从细胞分离纯化后可在体外与探针杂交，也可直接在细胞或组织内进行原位杂交。 基本内容 一、原位杂交的基本原理 二、原位杂交的分类 三、发展起的新技术 四、原位杂交的特点 五、基本步骤 六、在遗传学研究中的应用 七、课堂小结 八、作业 一、原位杂交的基本原理 原位杂交是基于DNA分子变性和复性原理而发展起来的一种技术。两条不同来源的但具有同源性的核苷酸单链片段在适宜的条件下能够按照碱基互补配对原则通过氢键相互结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双链分子。 用带有标记（放射性同位素、荧光染料等）的DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA)片段进行杂交，然后用相对应的检测方法（放射自显影等）予以显示，在光镜或电镜下观察目的DNA或mRNA的存在，并对其进行准确定位。 一、原位杂交的基本原理 原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。 其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。 根据分析检测对象的不同，分为：菌落原位杂交、组织原位杂交和基因组原位杂交。 1、菌落原位杂交： 将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释出DNA或RNA。将DNA或RNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 2、组织原位杂交： 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 3、基因组原位杂交： 基于核酸分子杂交的基本原理，用标记的核酸探针，经过检测系统，对染色体和染色体组整体进行分析检测的一种手段。 三、发展起的新技术 1、地高辛原位杂交 2、荧光原位杂交（FISH） 3、多色荧光原位杂交 4、比较基因组原位杂交 5、RNA原位杂交 三、发展起的新技术 1、地高辛原位杂交 地高辛是一种类固醇半抗原化合物，化学名为异羟基洋地黄毒苷，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成Dig-11-dUTP。通过随机引物法或缺口平移法，将Dig-11-dUTP与探针核酸分子相连制备成标记探针。将其与组织，细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下进行互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗地高辛抗体Fab结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位得以显色或产生荧光以达到检测目的。 三、发展起的新技术 1、地高辛原位杂交 优点： *对人体无害 *不受半衰期时间的限制，探针可以长期保存 *不受组织、细胞中内源性生物素的干扰 *分辨率和敏感性与同位素标记探针不相上下 *染色鲜艳、反差好 *成本低 三、发展起的新技术 2、荧光原位杂交(FISH) 它是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。 三、发展起的新技术 2、荧光原位杂交(FISH) 基本原理: 将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。 三、发展起的新技术 2、荧光原位杂交(FISH) 优点： *安全、快速、灵敏度高 *探针能长期保存 *能同时显示多种颜色 *不但能显示中期分裂相，还能显示间期核 *与局限于活细胞、灵敏度相对