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酶联免疫吸附试验ELISA法 二对半测定 标记免疫技术 标记免疫技术=免疫技术+标记技术 　　　　技术发展过程 荧光免疫技术 放射免疫技术 酶免疫技术 化学发光技术 金标技术 特点:灵敏度高、特异性强、操作简便、易于商品化和自动化 替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术 用于抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查。 酶免疫技术 酶免疫技术是三大经典免疫标记技术之一，它是把抗原抗体的特异性免疫反应与酶的高效催化作用原理有机地结合起来，是取代放射免疫技术的主要方法之一。 酶联免疫吸附试验（ELISA法）enzyme linked immunosorbent assay （一）基本原理 将抗体(抗原)包被在固相表面后，按不同的步骤加入待测抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)，充分反应后用洗涤的方法，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，洗去游离的酶标抗体(抗原)，最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，而对标本中的抗原(抗体)进行定性或定量。 ELISA类型 1．双抗体夹心法 特点： 非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 2．间接法 3、竞争法 用已知抗原(抗体)包被，加入待测血清，再加酶标抗体(抗原)，加底物显色。酶标物与待检物竞争与包被物结合。因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗体（抗原）的量呈反比用于检测抗体(抗原)。加底物显色：待测管颜色越淡，表示标本中抗体含量越多。 3.竞争法 特点： 用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。 酶标Ag（Ab）与样品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。 反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。 反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。 4.捕获法 主要用于 传染病的早期诊断（如IgM的测定）。 基本原理： 　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体， ②酶标记的抗原或抗体， ③酶作用的底物。 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 一、固相载体 　　除了均相酶免疫测定外，各种异相酶免疫测定反应最后都需分离游离和结合的酶标记物。固相抗体（抗原）作为最有效和简便的分离方法是固相酶免疫测定必不可少的组成。 1 .固相载体要求 结合容量大 结合稳定 保持抗原抗体活性 简便经济快速 2.固相载体种类 （1）塑料制品（聚苯乙烯） 材料经济，操作简便，易于自动化，最常用。 （2）微颗粒 结合容量大，反应迅速，逐渐普遍用于自动化分析。 （3）膜载体 硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，样品量微少，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA。 【 实验试剂与器材 1 包被干条板 2 酶结合物（HRP：辣根过氧化物酶） 3 阳性对照物 4 阴性对照物 5 浓缩洗涤液（PH 7.4PBS－Tween20）（用前以蒸馏水作 25 倍稀释） 6显色剂A（四甲基联苯胺） 7 显色剂B（H2O2） 8 终止液 （2M H2SO4） 操作步骤 1 第一孔加入阴性对照50 μL、第二孔加入阳性对照50 μL、第三、第四孔加入待测标本50 μL。 2 每孔加酶结合物 一滴，充分混匀。 3 eAb检测孔加入中和抗原（HBeAg)50 μL、混匀,封板置 37?C 孵育 30 分钟。 4 手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置 1分种，甩干，重复 5 次后拍干,最后一次拍干。 操作步骤 注意请3-5组合并一块酶标板上再显色！ 5 每孔加显色剂 A、B 液各 一滴，充分混匀，置 37?C 孵育 15 分钟。 5 每孔加终止液一滴，混匀。 6 使用双波长的酶标仪比色，主波长 450 nm，参考波长 630 nm，然后读取各孔 OD 值。 结果判断　 　 1 肉眼判定： 夹心法：明显显色者判阳性，否则判阴性 竟争法：明显显色者判阴性，否则判阳性 2 酶标仪判定：TMB显蓝色，加终止液显黄色，最大吸收波长为450nm，测定并记录OD450值。 Cut off value(临界值) Cut of