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PCR的影响因素之一 PCR的影响因素之二 PCR主要影响PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。（一）温度循环参数。在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94 60 s，37 60 s，72 120 s，共25～30个循环，扩增片段500 bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环 3 0～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。 PCR的影响因素之三 引物：在Tris缓冲液中，引物可以低温保存相当长的时间。除非有核酸酶的污染，引物 一般非常稳定。笔者使用过10年前的引物，仍然好用。问题的关键在于您的引物设计是否合理，使用过程是否规范。如果您怀疑引物有问题，可以选择重合。如果 重合后，还没有改善，请查其他原因。引物到用户手头前都是以干粉形式存在的，干粉很容易丢掉，引物溶解后可以测定一下OD，将所有引物的浓度调整到一致， 对实验有一定帮助。 ??? 高温聚合酶：高温聚合酶是非常稳定的，除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供 的酶扩增是有差异的，活性定量和标示未必相同。选用表现一贯稳定的酶，而不是最便宜的。当然，便宜又好最好，哪里有？我们这里啊！ ??? dNTP: dNTP是PCR扩增体系中最不稳定的，反复冻融会使dNTP发生降解。dNTP是由dATP,dCTP,dGTP,dTTP等摩尔组成，但是他们的稳定 性不同，发生降解的程度不同，导致4种dNTP的浓度不一致，即使不发生降解，4种 dNTP如果浓度不等，PCR效率和正确率都会受到影响。建议分装小包装，减少反复动容冻融的次数。 ??? 缓冲液：缓冲液一般不容易出问题，只是使用前需要彻底融化混匀使用。如果您 PCR不熟悉，使用含Mg的缓冲液。缓冲液中可以加入适量的甘油、DMSO等增强剂，目的是改善高GC含量等疑难模板的扩增。 ??? Mg2+:是TAQ活性所必须的，浓度过高过低对反应都有比较大的影响。过低 （1mM），合成效率会下降，过高（3mM），非特异性会加大。很多因素会使Mg2+的实际浓度受到影响，如TE中的EDTA, 反应用的dNTP等都会螯和Mg. ? 　温度：变性和退火温度是主要需要考虑的。变性温度过高（一般在90-94C）， 时间过长（一般45-60秒足够），酶的活性会受到影响，同时影响产率。对于退火温度，过低非特异性扩增增加，过高产率会下降。需要根据引物的长度，用 途，组成确定退火温度和时间。 ? 　模板：PCR?的关键之一，模板不是越多越好。可以通过倍比稀释来确定合适的浓 度。纯度,不是最重要，但是不能有抑制Taq活性或螯和Mg 的试剂存在。模板的pH值接近中性为合适，否则会影响扩增体系的pH值。 　　关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500 bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作