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实验一 微生物制片及形态观察 一、细菌简单染色法及形态观察 （一）基本原理 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌丝体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。 经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 （二）实验材料 1．菌种：大肠杆菌、酵母菌的斜面培养物。 2．染色剂：吕氏碱性美蓝、草酸铵结晶紫等。 3．仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸等。 （三）实验步骤 1. 涂片：取一块载玻片，滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接环以无菌操作的方法，从菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀，并涂成薄膜。涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 2. 干燥：室温自然干燥或烘干。 3. 固定：涂面朝上，通过火焰2～3次。 此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上；同时还可以杀死菌体；增加菌体与染料的结合力。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。 4. 染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加1~2滴染液于涂片上。草酸铵结晶紫染色约1 min；若用吕氏碱性美蓝、或石炭酸复红染色1～2 min。 5. 水洗：倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接用水冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端经涂面流向另一端，水流不宜过急过大，以免涂片薄膜脱落。 6. 干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。 7. 镜检：涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。 （四）实验报告内容 根据观察结果，绘出所观察细菌的形态图。 二、革兰氏染色法 （一）基本原理 革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫－碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同的。革培养氏阳性细菌，细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖形成的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。而革兰氏阴性菌：细胞壁肽聚糖层较薄、网状结构交联少，且类脂质含量较高，经乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫－碘的复合物被溶出细胞壁，细胞被脱色，复染后，细胞被染上复染剂的颜色。 （二）实验材料 1．菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。 2．染色剂：革兰氏染色液。 3．仪器或其他用具同实验一。 （三）实验步骤 1．制片：取菌种培养物按常规涂片、干燥、固定。 要用活跃生长期的幼龄培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 　 2．初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色2 min。 3．媒染：先用水冲去染色液，再用滴加碘液覆盖约1 min。 4．脱色：将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30 s。 5．复染：用蕃红液复染约2 min，水洗。 6．镜检：干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝色的是革兰氏阳性菌，被成红色的为革兰氏阴性菌。 混合涂片染色：按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片进行比较。 （四）实验报告内容 根据观察结果，绘出所观察细菌的形态图。 三、细菌的芽孢染色 （一）基本原理 芽孢又叫内生孢子是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置以及芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行简单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椰圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。 芽孢染色是用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不